不同肥料處理對煙葉機械承受能力的影響及其機制研究

何海麗，黃 強，代瑾然，廖菊夠，王建光，吳金虎，王繼明，鄭元仙，吳 劍，何元勝，魏 佳，許銀蓮，周厚發，陳穗云*

(1.云南大學生命科學學院植物科學研究所，云南 昆明 650091；2.云南省煙草公司臨滄市公司，云南 臨滄 677099)

植物葉片折斷或脫落的現象十分復雜，根據折斷、脫落發生的時期，通常將葉片折斷分為兩種情況，一種是葉片正常成熟衰老后自然脫落；另外一種是葉片在未成熟的正常生長時期，受到外力影響而過早從葉柄處折斷[1]。【研究意義】煙草是世界上廣泛種植的重要經濟作物之一，經濟價值最高的中部或中部偏下的煙葉，在處于快速生長尚未達到成熟的時期，受到較大風、雨或人畜走動觸碰等外力因素后，易從葉柄近基部折斷，這種機械折損給煙葉生產造成重大經濟損失。其出現的原因和機理目前在國內外鮮見報道。【前人研究進展】煙葉這種非正常折斷原因的推測和研究可以借鑒作物莖桿倒伏的研究。目前對作物抗倒伏研究較多的是水稻、小麥、玉米和油菜等作物[2]。煙草的經濟器官主要是葉片，主葉脈結構的完整性是保證葉脈抗折損、葉片正常發育成熟必不可少的因素，影響結構發育成熟的因素包括溫度、濕度、光照強度、土壤中的水分及營養物質含量等，在同等氣候條件下，營養物質是影響煙草葉脈結構完整性的主要因素[3]。研究表明，不同的肥料處理能夠提高農作物抗倒伏的能力[4]。作物莖桿中木質素含量與莖桿強度具有相關性，提高木質素含量能夠有效提高作物抗倒伏的能力[5]。過氧化物酶(POD)和L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)是木質素合成的限速酶，提高它們的酶活性能促進木質素的合成[6]。莖桿的抗倒伏能力與莖桿的解剖學結構密切相關[7]。凌啟鴻、吳澤芳等研究認為莖桿組織結構包括維管束數目及厚壁細胞厚度與抗倒伏呈正相關[8]。水稻莖桿的抗倒性與莖桿的機械強度成正比，莖桿機械強度與維管束的數目、大小、分布等密切相關，維管束數目越多，抗倒伏能力越強[9]。【本研究的切入點】由于不同肥料處理會對作物抗倒伏能力、作物莖桿中木質素含量及莖桿機械強度產生影響。因此，合理施用肥料對增強煙葉機械承受能力、降低煙葉田間折斷率具有重要意義。【擬解決的關鍵問題】本試驗用不同的肥料處理臨滄市的主栽烤煙云煙87，檢測不同處理對煙葉最大機械承受能力的影響，測定木質素含量及其合成過程中關鍵酶POD和PAL活性，通過石蠟切片觀察易折斷和抗折斷煙葉主葉脈解剖結構的特征與差異，研究其作用機制，為降低煙葉田間機械折斷率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地基本情況

試驗于2016年3-11月在臨滄市臨翔區博尚鎮永泉村大田實驗基地進行。土壤類型為壤土，前茬作物為油菜，土壤pH值為5.36，有機質2.65 %，水解性氮126.1 mg/kg，有效磷95.7 mg/kg，速效鉀 72 mg/kg，有效硼0.72 mg/kg，有效鋅4.07 mg/kg。

1.2 試驗設計

試驗為同田對比試驗，設7個處理組和1個對照組。各處理在對照組的施肥基礎上，分別增施不同種類的肥料，具體肥料種類、用量、施用時期和方法如表1所示。

表1 肥料種類、用量、施用時期和方法

種植面積0.268～0.335 hm2，每個處理種植不少于100株，隨機重復3次，行株距120 cm×50 cm。試驗地選擇有代表性、土壤肥力均勻、地面平整、排灌方便、肥力中上等水平的同一地塊。其它栽培管理措施按照當地烤煙生產規范要求進行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 機械折斷率測定 在烤煙移栽后70、90和110 d選取長勢良好、均一、3個葉位煙葉的主葉脈大小分別相近、無病蟲害的植株，采用砝碼測試的方法分別檢測腳葉、下二棚、腰葉3個部位的最大機械承受重量。測試方法：將砝碼裝入自封袋，用夾子同時夾住自封袋口和離葉柄基部1/3位置處的主葉脈，使裝有砝碼的自封袋懸垂于空中，從100 g起始，每次增加5 g，觀察煙葉是否折斷，每個時期及每個部位隨機統計25株，每株每個部位測定3～4片葉。記錄造成這3個葉位煙葉折斷的最大砝碼重量，對應為相應葉位的最大承受重力。最后分別計算出對照組不同部位的煙葉的平均最大承受重量。通過測試結果確定了各部位煙葉的平均最大承受重量如下：腳葉(第1～3片)，距離地面約20 cm，砝碼重量為410 g；下二棚(第4～6片)，距地面約30 cm，砝碼重量為380 g；腰葉(第7～16片)，距地面約50 cm，砝碼重量為350 g。用該平均重量去檢驗各個處理組的煙葉承受能力，將每個處理各部位折斷的葉片數除以該部位測試總葉片數即為機械折斷率。

1.3.2 木質素含量測定 分別測定各個時期3個葉位折斷煙葉和非折斷煙葉主葉脈的木質素含量。木質素含量按照參考文獻[10]的方法測定，結果以A280 nm下的吸光值表示。

1.3.3 POD活性測定 分別測定各時期3個葉位折斷煙葉和非折斷煙葉葉肉組織中過氧化物酶活性。POD活性按照參考文獻[11]的方法測定。

1.3.4 PAL活性測定 分別測定各時期3個葉位折斷煙葉和非折斷煙葉葉肉組織中L-苯丙氨酸解氨酶活性。PAL活性參照張志良等[12]的方法測定。

1.4 解剖結構的觀察

取各時期3個葉位折斷煙葉和非折斷煙葉離莖桿基部約2 cm處的主葉脈，切成0.5～0.8 cm的小段，用FAA固定液固定保存。采用石蠟切片法切成8 μm的薄片，番紅-固綠雙重染色，中性樹膠封片，用顯微鏡觀察主葉脈橫切面的機械組織、木質部、維管束等結構。

1.5 數據分析方法

所有統計數據均采用Graghpad Prism 6.01作圖，并用SPSS 19.0進行數據處理和統計分析。用單因素方差分析各個處理組在不同移栽時間及不同部位的折斷率、木質素含量、酶活性和維管束厚度的差異，最后用post-hoc比較各個肥料處理間的差異。用不成對的t檢驗比較易折損組與抗折損組在木質素含量和酶活性中的差異。

2 結果與分析

2.1 肥料處理對煙葉機械折斷率的影響

肥料處理對煙葉機械折斷率會產生不同程度的影響，如圖1所示，增施不同肥料后，各部位煙葉折斷率與常規施肥(CK)對比發現，T2處理(硫酸鉀)、T3處理(農用硼砂)、T4處理(水溶性有機鉀)、T5處理(水溶性有機鉀+噴施含微量元素的菌肥)和T6處理(含微量元素的菌肥)的腳葉、下二棚、腰葉的折斷率在移栽后70、90和110 d分別都比CK相應時期對應部位折斷率低，具有顯著差異(P<0.05)。T1處理(農用硫酸鋅)移栽后70 d，腳葉折斷率較CK折斷率低，具有顯著差異(P<0.05)，而其下二棚、腰葉折斷率與CK組無顯著差異(P>0.05)；T1處理移栽后90 d，腰葉的折斷率與CK相比，無顯著性差異(P>0.05)，腳葉和下二棚的折斷率與CK相比有所減少(P<0.05)；T1處理移栽后110 d，與CK相比，腳葉和下二棚的折斷率沒有顯著性變化(P>0.05)，腰葉的折斷率有所減少(P<0.05)。T7處理(微生物菌肥+含微量元素的菌肥)移栽后70 d，與CK相比，腳葉和腰葉折斷率均無顯著差異(P>0.05)，下二棚有所增加(P<0.05)；T7處理移栽后90 d，腳葉和腰葉與CK相比折斷率均無顯著差異(P>0.05)，下二棚與CK相比顯著增加(P<0.05)；T7處理移栽后110 d，腳葉、下二棚和腰葉與CK相比均無顯著差異(P>0.05)。相比之下，T7處理在不同移栽時期及不同部位均顯示較高的折斷率，T5處理及T6處理在移栽后70 d均表現出較顯著的抗折斷效果，T3處理在移栽后90 d呈現出較顯著的抗折斷效果，T2處理在移栽后110 d的腳葉和下二棚表現出最顯著的抗折斷效果。

組內不同字母表示各肥料處理組之間的顯著性差異(P<0.05)，下同Bars within groups with different letters indicated significant differences among the fertilizer treatments (P<0.05). The same as below圖1 不同肥料處理對云煙87煙葉機械折斷率的影響Fig.1 The effect of different fertilizers on the rate of mechanical fracture of tobacco leaves

圖2 易折斷與抗折斷的煙葉中木質含量差異Fig.2 The difference of lignin content between easy fracture leaves and fracture resistant leaves

圖3 煙葉機械承受能力與木質素含量的相關性分析Fig.3 The correlated analysis of tobacco leaves mechanical strength and lignin content

2.2 煙葉機械承受能力與木質素含量相關性

為檢驗煙葉機械承受能力是否與木質素含量相關，測定易折斷的煙葉與不易折斷的煙葉的木質素含量，結果如圖2所示。與不易折損的煙葉相比，不同葉位易折斷煙葉的主葉脈中的木質素含量在移栽后70 d均顯著偏低(P<0.05)。移栽后90 d，易折損的腳葉與不易折損的腳葉的木質素含量沒有統計學差異(P>0.05)；下二棚和腰葉，不易折斷的葉脈木質素含量比易折斷組高(P<0.05)，移栽后110 d，易折損與抗折損的煙葉的木質素含量在下二棚沒有顯著性差異(P>0.05)，腳葉和腰葉均有顯著性差異(P<0.05)。通過測定不同煙葉的木質素含量及其最大承受機械重量，將結果做關聯性分析，結果如圖3所示，煙葉所能承受的最大重量與主葉脈中的木質素含量呈正相關。

2.3 不同肥料處理對煙葉中木質素含量的影響

不同肥料處理組木質素含量變化如圖4所示，移栽后70 d，T1處理的木質素含量與CK處理在腳葉有所增加，而下二棚和腰葉沒有顯著性變化(P>0.05)；移栽后90 和110 d，T1處理的木質素含量在腳葉和腰葉與CK相比均無顯著性差異(P>0.05)。移栽后70、90和110 d，T2、T3、T4處理的木質素含量在腳葉和腰葉與CK相比均有顯著性增加(P<0.05)。T7處理在移栽后70 d腳葉木質素含量與CK相比顯著增加(P<0.05)，下二棚和腰葉沒有顯著性變化(P>0.05)，移栽90和110 d的腳葉、下二棚和腰葉與CK相比均無顯著性變化(P>0.05)。相比之下，T2處理的木質素含量在移栽后110 d的腳葉最高；T3處理的木質素含量在移栽后90 d的不同部位最高；T6處理的木質素含量在移栽后70 d的下二棚和腰葉均最高，在移栽后110 d的下二棚和腰葉最高。

2.4 POD和PAL活性對煙葉木質素含量的影響

易折斷與抗折斷的煙葉的POD活性變化如圖5所示，移栽后70、90和110 d，抗折損的煙葉POD活性在腳葉、下二棚和腰葉均比易折損煙葉高(P<0.05)。

圖4 不同肥料處理對云煙87煙葉中的木質素含量的影響Fig.4 The effect of different fertilizers on the lignine content of tobacco leaves

易折斷與不易折斷的煙葉中木質素合成關鍵酶(PAL)的活性如圖6所示，移栽后70、90和110 d，不易折損的煙葉的PAL活性在腳葉、下二棚和腰葉均比易折損煙葉高(P<0.05)。

2.5 不同肥料處理對煙葉主葉脈結構的影響

易折斷與不易折斷煙葉主葉脈的結構如圖7所示，易折斷煙葉的葉脈木質部中維管束的厚度比不易折斷煙葉小，維管束數目相對較少，相鄰維管束間的距離相對較大，維管束外組織細胞排列相對疏松，而且單個維管束比較薄。移栽后70、90和110 d，不易折損的煙葉維管束層的厚度在腳葉、下二棚和腰葉都比易折損煙葉大。

不同肥料處理組煙葉主葉脈中的維管束厚度變化如圖8所示，移栽后90 d，T1處理的維管束厚度在腰葉和下二棚較CK有顯著增加(P<0.05)，而在腳葉沒有顯著性變化(P>0.05)，T2、T3、T4、T5

圖5 易折斷與抗折斷的煙葉中POD活性差異Fig.5 The difference of POD activity between easy fracture leaves and fracture resistant leaves of tobacco

圖6 易折斷與抗折斷的煙葉中PAL活性差異Fig.6 The difference of PAL activity between easy fracture leaves and fracture resistant leaves of tobacco

圖7 易折損與抗折損的煙葉主葉脈橫切面結構比較Fig.7 The transverse section difference of the structure of main leaf vein between easy fracture leaves and fracture resistant leaves

圖8 不同肥料處理對移栽后90 d煙葉中的主葉脈中維管束厚度的影響Fig.8 The effect of different fertilizers on vascular bundle thickness in main leaf vein of tobacco leaves

和T6處理中的維管束層厚度在腳葉、下二棚和腰葉與CK相比均顯著性增加(P<0.05)。T7處理的維管束厚度與CK相比在腳葉和腰葉均無顯著性變化(P>0.05)，在下二棚較CK有顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

研究已明確，不同的肥料處理對煙葉的機械承受能力會造成不同的影響，硫酸鉀、硼砂、水溶性有機鉀、水溶性有機鉀+噴施含微量元素的菌肥和含微量元素的菌肥處理云煙87，在移栽后70、90和110 d均能顯著減少腳葉、下二棚和腰葉的折斷率。有大量研究還表明用氮肥或鉀肥處理農作物能影響農作物的組織結構發育，提高作物莖桿的韌性，從而起到抗倒伏的作用[13]。在作物生長及發育時期，肥料中的大量元素及微量元素對于植物莖桿及葉脈的結構形成起到非常重要的作用。煙葉的折斷與農作物的倒伏相似，都是由自身抗機械折損能力及環境因素共同作用的結果[3,14]。研究顯示，不同肥料處理對煙葉的機械折斷率都有不同程度的影響，但不是任意肥料都能發揮類似的效果。硫酸鋅和含有微量元素的菌肥在抗機械折斷中的作用并不突出，在不同時期及不同部位無法呈現一致性變化，這種現象可能與作物不同部位及不同時期對肥料需求的多變性相關[3]。當然肥料作用有其局限性，可能與施肥的濃度及施肥的方式也有關，另外氣候因素、生態因素對其也會有影響。其它的五個處理在不同時期及不同部位都呈現出一致性變化，說明鉀肥、硼肥及微量元素能夠提高煙葉抗機械折斷能力。

在植物抗倒伏研究中，作物莖桿中木質素含量高低是判斷作物抗倒伏能力的一個重要指標[15]。在細胞壁木質化過程中，木質素逐漸滲入細胞壁，填充于纖維素構架中，增強了植物體的機械強度，利于疏導組織的水分運輸和抵抗不良外界環境的侵襲[16]。因此，木質素的含量與作物莖桿的剛性密切相關。植物莖桿中木質素含量越大，植物的抗折力就會越強[17]。由此推斷，煙葉機械折斷的發生與主葉脈中的木質素含量偏低有關。研究顯示，相較于抗折斷的煙葉，易折損的煙葉主葉脈木質素含量普遍偏低，不同葉位及不同時期都呈現出一致性變化趨勢，煙葉的最大機械承受能力與主葉脈中的木質素含量呈正相關。表明煙葉的田間機械折斷與其木質素含量密切相關[18]。用硫酸鉀、硼砂、水溶性有機鉀、水溶性有機鉀+噴施含微量元素的菌肥和含微量元素的菌肥處理云煙87后，在移栽后70、90和110 d均能顯著增加腳葉、下二棚和腰葉木質素含量，結果與其抗機械折斷作用一致。表明上述肥料起抗機械折斷作用主要是由于主葉脈的木質素含量增加[4]。

研究表明，POD和PAL是木質素合成過程中的關鍵酶，它們的活性與木質素的含量息息相關[19]。POD是植物體中活性較高的一種酶，它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關系。在植物生長發育過程中它的活性不斷發生變化[20]。過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉化成木質素，增加木質化程度，因此，過氧化物酶的活性是植物體酶活力的標志[15]。PAL是莽草酸途徑中的一個限速酶，它主要通過催化苯丙氨酸的脫氨反應，使NH3釋放出來形成反式肉桂酸，此酶在植物體內次生物質(如木質素等)代謝中起重要作用，該酶的活性下降會直接導致木質素的合成量減少[5]。實驗結果表明易折斷的煙葉主葉脈中POD活性和PAL活性都顯著低于抗折斷組。同時這2個酶的活性與木質素含量成正相關。說明肥料處理可能是通過影響木質素合成關鍵酶來影響木質素含量，從而影響其機械承受能力。木質素是構成植物機械組織的主要成分之一，木質素的減少會影響機械組織的正常形成，導致植物組織結構的異常，最終促使植物莖稈強度降低使其容易折損[20]。

作物的抗倒伏性與莖桿機械強度成正比，維管束數目越多，抗倒伏能力越強。莖桿中維管束長度和寬度是評價莖桿質量優劣的良好指標[2]。實驗的顯微結構結果中發現易折斷煙葉主葉脈的維管束厚度與抗折斷組具有顯著性差異，易折斷組的維管束層厚度較小，同時單個維管束的厚度也比抗折斷組小。通過肥料處理能夠增加煙葉維管束層的厚度，與其對木質素含量以及抗機械折損的結果一致。

4 結 論

對云煙87增施硫酸鉀、硼砂、水溶性有機鉀、水溶性有機鉀+噴施含微量元素的菌肥和含微量元素的菌肥后，腳葉、下二棚和腰葉主葉脈中木質素含量提高，木質素合成關鍵酶POD和PAL活性增大，煙葉主葉脈中維管束厚度和機械強度增加，煙葉機械承受能力顯著增強，田間折斷率降低。