菜心抗蟲性的cDNA-AFLP分析

康紅衛,史衛東，羅海玲，周建輝，踞茜茜，張 力，農貴雄

(1．廣西農業科學院蔬菜研究所，廣西 南寧 530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】廣西具有獨特的溫光資源、大量的冬閑田及冬閑勞動力資源，發展蔬菜生產占有得天獨厚的條件，是國家“南菜北運”重要基地，是粵港澳等地的“后菜園”，也是對東盟地區出口外銷蔬菜的生產大基地和運輸大通道。廣西氣候溫和，有利于蔬菜生產，但同時也利于病蟲害發生。其中小菜蛾每年繁殖17～20代，危害十分嚴重，因此，開展菜心抗蟲性研究，對廣西蔬菜抗蟲品種選育及食品安全均具有非常重要的生產意義[1-2]。【前人研究進展】cDNA-AFLP是一種結合AFLP和mRNA差異顯示技術的分子標記，具有重復性好、假陽性低、多態性高、通用性好、無需基因組信息、準確反應基因差異表達和轉錄組信息等優點[3-4]，廣泛應用于植物轉錄圖譜的構建和抗病蟲相關基因的檢測和分離。在馬鈴薯上利用cDNA-AFLP標記構建轉錄圖譜的研究表明，與基因組標記相比，轉錄組標記可以作為遺傳標記用于構建遺傳圖譜，不在染色體特定區域簇集，cDNA-AFLP標記在轉錄激活區域富集，cDNA-AFLP標記是由轉錄本的DNA多態性標記產生的，在分子標記輔助育種、遺傳分析和圖位克隆上很有潛力[5]。在木薯利用cDNA-AFLP分析獲得了一對親本的500 多個TDFs，利用部分TDFs進行遺傳圖譜構建，結果表明TDFs比隨機cDNA多態性更多[6]。在棉花上利用cDNA-AFLP剖析棉纖維發育次生壁加厚期基因表達譜和轉錄組圖譜，結果獲得大量與棉纖維基因相關基因[7]，在利用171個株系的棉花永久F2群體構建的轉錄組圖譜上，可以通過環境變量鑒定出來與產量和產量組成性狀QTL，相關分析表明TDFs與雜種的產量和產量雜種優勢相關，這些TDFs是潛在的功能基因，對分子標記輔助選擇非常有價值[8]。在白菜類蔬菜上，以矮腳黃白菜和白蔓菁蕪菁自交系的雜交組合，構建含164個cDNA-AFLP 標記的轉錄圖譜分布在13個連鎖群上[9]，以抽薹極遲和極早的菜心為親本獲得的F2作圖群體的轉錄組圖譜，67個cDNA-AFLP 標記分布在4個連鎖群上，為抽薹相關基因定位、比較基因組學研究和克隆提供重要的參考信息[10]。此外，cDNA-AFLP技術也廣泛應用于植物抗蟲性研究，在擬南芥[11]、馬鈴薯[12]、甜菜[13]、蘋果樹[14]和茶樹[15]等作物上已有較多相關研究，黃家保等[16]利用新一代測序技術分析小菜蛾取食菜心后的 mRNA 表達變化，發現大量編碼轉錄因子、激酶和蛋白的基因被誘導表達，涉及多種脅迫反應途徑。【本研究切入點】本研究團隊前期研究利用EST-SSR分子標記初步進行了菜心抗小菜蛾的抗性遺傳分析[17]，抗蟲菜心群體連鎖遺傳規律及抗蟲分子機制還存在高密度轉錄圖譜構建及抗性相關基因未知等問題，而利用cDNA-AFLP技術從轉錄組水平上分析抗蟲菜心群體的連鎖遺傳規律及抗蟲分子機制目前尚未見相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】擬利用cDNA-AFLP標記技術構建轉錄圖譜、分析差異基因表達，篩選和克隆抗蟲相關轉錄衍生片段，從轉錄組水平上分析抗蟲性的分子遺傳規律，旨在從轉錄組水平探討菜心抗蟲性的分子機制，為抗蟲品種選育和抗蟲基因挖掘提供理論支持和中間材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2013-2016年在廣西農業科學院蔬菜研究所科研基地開展試驗，將抗小菜蛾品種Caixin65和感小菜蛾品種Caixin69的雜交， F1自交，將96個F2單株及2個親本用于分析。在齊口期采集葉片，立即置于液氮中，并轉移至-80 ℃低溫冰箱保存。主要試劑：pMD18-T Simple Vector、大腸桿菌(Escherichia coli)DH 5α 感受態細胞、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和DNA marker均購置于TaKaRa 公司(大連)；SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 反轉錄試劑盒、TRIzol 試劑盒、RNase H 、DNA Polymerase 和DNA Ligase均購置于Invitrogen 公司(美國)；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購置于天根生化科技有限公司(北京)。瓊脂糖、聚丙烯酰胺、甲叉雙聚丙烯酰胺、硝酸銀、氫氧化鈉、硫代硫酸鈉、冰醋酸和甲醛均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。cDNA-AFLP的接頭及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 菜心RNA提取及cDNA-AFLP分析

菜心Total RNA 的提取采用TRIzol 試劑并按照說明書進行，應用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒說明書步驟合成cDNA 第1鏈。反應體系(10 μl)：1 μl 3′ RACE Adaptor (5 μmol/μl)，2 μl 5×Buffer，1 μl dNTP 混合物(10 mmol/L)，0.25 μl RNase Inhibitor (40 U/μl) ，5.5 μl 總RNA (1 μg/μl) 和0.25 μl M-MLV (200 U/μl)反轉錄酶。混勻后在42 ℃放置60 min 后合成cDNA 第1 鏈。第2鏈cDNA合成反應體系：10 μl buffer2(10×)，5 μlE.coliDNA Polymerase，1.5 μlE.coliDNA Ligase，1 μl RNaseH，3 μl dNTP(10 mmol/L)，20 μl第1鏈cDNA產物，補充超純水至100 μl，16 ℃反應2.5 h，80 ℃ 15 min滅活酶活性；加入4 μl的T4DNA Polymerase，37 ℃反應10 min。EcoRⅠ、MseⅠ酶切及連接體系：含cDNA 模板4 μl DNA(50 ng/μl)，接頭Adapter 1 μl，限制性內切酶EcoRⅠ/MseⅠ2 μl，10×Reaction Buffer 2.5 μl，10 mmol/L ATP2.5 μl，T4連接酶1 μl，ddH2O 7 μl。37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過夜。預擴增反應體系(25 μl)：連接產物 3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 2.0 μl，EcoRI預擴增引物 (10 μM) 1.4 μl，MseI 預擴增引物 (10 μM) 1.3 μl，TaqDNA 聚合酶0.3 μl，補充RNase free ddH2O至25 μl。反應程序：預變性94 ℃ 2 min；94 ℃變性30 s，50 ℃復性30 s，72 ℃延伸80 s，擴增30 輪，72 ℃延伸5 min。預擴增產物用0.1×TE 按1：20 稀釋作為模板。選擴增反應體系(25 μl)：預擴增稀釋產物(1 ng/μl)3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μl，EcoRⅠ選擴增引物(10 μM)1.0 μl，MseⅠ選擴增引物(10μM)1.0 μl，TaqDNA 聚合酶(1 U/μl) 0.2 μl，RNase free ddH2O補充至 25 μl。反應程序：94 ℃變性30 s，65 ℃復性30 s，72 ℃延伸80 s，擴增14 輪，每輪退火溫度降低0.7 ℃；94 ℃變性30 s，50 ℃復性30 s，72 ℃延伸80 s，擴增循環23 輪；72 ℃延伸5 min。電泳檢測：選擇性擴增產物通過6 %的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，硝酸銀溶液快速染色，拍照分析條帶差異情況，然后自然干燥保存。接頭和引物序列見表1。

1.3 差異片段的回收、克隆以及測序

將非變性PAGE膠板上的差異片段用刀片割下放入200 μl PCR管子中搗碎，加入20 μl ddH2O，95 ℃保溫5 min，自然冷卻。取 2 μl 上清液為模板，以獲得差異表達條帶的引物和擴增條件進行二次 PCR 擴增。反應體系：上清液2.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μl，EcoRⅠ選擴增引物(10 μM)1.0 μl，MseⅠ選擴增引物(10 μM)1.0 μl，TaqDNA 聚合酶(1 U/μl) 0.2 μl，RNase free ddH2O補充至 25 μl。反應程序：94 ℃變性30 s，65 ℃復性30 s，72 ℃延伸80 s，擴增14 輪，每輪退火溫度降低0.7 ℃；94 ℃變性30 s，50 ℃復性30 s，72 ℃延伸80 s，擴增循環23 輪；72 ℃延伸5 min。取 50 μl二次擴增 PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外光下回收PCR 產物。用天根瓊脂糖膠回收試劑盒純化回收的片段，將目的片段連接到克隆載體pMD18-T上，轉化大腸桿菌 DH5α 感受態細胞，經藍白斑篩選，挑選克隆送生工生物工程(上海)有限公司測序。

表1 用于 cDNA-AFLP 分析的接頭、預擴增和選擇性擴增的引物序列

Table 1 Adaptors and primer pairs used for cDNA-AFLP analysis

1.4 AFLP分子標記的統計與分析

非變性聚丙烯酰胺凝膠板上，每條擴增條帶均作為一個分子標記，記為“1”，未出現擴增帶記為“0”，而對于一些模糊不清，難判讀或由于其他原因使數據缺失的帶型則記錄為“-”，以此作為數據記錄的標準。

1.5 cDNA-AFLP轉錄圖譜構建

利用獲得的F2群體的cDNA-AFLP標記進行連鎖分析，對分離數據進行適合性測驗，用符合1∶1 分離比例的標記構建連鎖圖譜。運用 JoinMap 4. 0 軟件構建分子遺傳圖譜，先用“New Project”命令創建一個新的文件夾，“Load data”命令導入標記數據，再用命令“Individual genot freq”排除缺失數據過多的單株，用“Locus genot freq”命令分析標記的偏分離情況，然后用 Group 命令進行分組，最后用 Map 命令構建分子遺傳圖譜，采用 Kosambi 函數計算圖距。

1.6 差異片段序列分析

克隆序列首先利用Cap3拼接，然后利用Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/)數據庫進行BLAST同源性比對分析，通過Clustal (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比對序列結構差異，利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線程序的鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統發育進化樹，利用STRING在線數據庫(https://string-db. org/cgi/input.pl)檢索TDFs的蛋白質功能信息。

表2 cDNA-AFLP標記在菜心F2代的多態性水平

2 結果與分析

2.1 cDNA-AFLP標記的多態性

一共選擇了14對引物組合進行cDNA-AFLP分析。不同引物組合的標記在菜心F2群體中顯示出較高的多態性，14對引物組合共擴增出330條擴增帶，其中238條為多態性帶，多態性條帶比例為56.00 %～100.00 %，平均為73.86 %，平均每對引物擴增24條帶，多態性條帶17個(表2)。結果表明cDNA-AFLP具有非常高的多態性，適合菜心差異基因表達研究。

2.2 cDNA-AFLP轉錄圖譜構建

對分離數據進行適合性測驗，用符合1∶1 分離比例的標記構建連鎖圖譜(圖1)。本研究使用 JoinMap 4.0 軟件構建的轉錄圖譜由5個連鎖群組成，193個標記未能定位在連鎖群上，42個位點定位在 5個連鎖群上，總長度為575.869 cM，平均圖距為 115.1738 cM。每個連鎖群上的標記數為2～23個，平均為8個，5個連鎖群的LOD值變化范圍為9.923～12.710，平均為13.207。A1連鎖群上的分子標記分布不均勻，成簇分布和出現了5個較大的斷裂。42個作圖位點中，共有18個偏分離位點，偏分離比例為42.86 %，其中11個偏向母本，偏分離比例為為26.19 %，7個偏向父本，偏分離比例為16.67 %(表3)。在330個位點中，異常分離位點(父母本沒有，子代有)103個，占總位點數的34.24 %。菜心F2群體存在顯著的偏分離現象。

2.3 cDNA-AFLP差異片段的分離、克隆和測序分析

選取表達量較高的差異表達位點進行回收和PCR 驗證，將陽性克隆進行雙向測序，經Cap3拼接獲得 10個TDF差異片段(表4)。利用DNAMAN和Brassica Database進行同源性比對，搜索與菜心TDF相關信息，檢索NCBI和sting獲得功能信息。

利用DNAMAN進行同源性比對，結果表明10條TDF的相似性只有53.55 %，表明差異表達片段之間具有不同的核苷酸片段或者堿基的插入或缺失，這也是cDNA-AFLP多態性產生的分子基礎。將TDF序列比對并利用Clustal Omega構建系統發育樹，發現1個TDF5-1-1與防御相關基因GW775571.1具有高度的序列同源性，8個TDF與大白菜花蕾敗育相關基因GR308173.1高度同源，1個與功能未知基因EX106546.1高度的序列同源(圖2)，結果表明，同為十字花科植物，菜心自成一類，但菜心與白菜(Brassicarapa)、白菜類蔬菜(B.campestris)、甘藍型油菜(Brassicanapus)、甘藍(Brassicaoleracea)、芥菜(Brassicajuncea)、蘿卜(Raphanussativus)、薺藍(Camelinasativa)、薺菜(Capsellabursa-pastoris)和擬南芥(Arabidopsislyrata)等十字花科植物仍然具有較近的親緣關系。

表3 cDNA-AFLP轉錄圖譜連鎖群的基本特征

圖1 菜心F2群體cDNA-AFLP 分子轉錄圖譜Fig.1 Transcriptome map of cDNA-AFLP markers with F2 population of flowering Chinese cabbage

3 討 論

3.1 cDNA-AFLP標記在菜心F2群體后代中的多態性水平

本研究選用14對引物組合進行cDNA-AFLP分析，平均每對引物擴增24條帶，多態性條帶17個，14對引物多態性條帶比例為56.00 %～100.00 %，平均為73.86 %，表明非變性聚丙烯酰胺凝膠的顯示帶數較少，但cDNA-AFLP仍具有較高的多態性，高于利用EST-SSR多態性結果[17]，表明cDNA-AFLP適合菜心差異基因表達研究。

表4 TDFs的同源性比對分析和功能分類

菜心(Brassica rapa var. parachinensis)：TDF5-1-1；白菜(Brassica rapa)：KY363864.1、AY395720.1、XM009140795.2、AB325668.1、XM009107912.2、XM009140796.2 、XM009140794.1 和AC232439.1；白菜類蔬菜(B.campestris): X77990.1；甘藍型油菜(Brassica napus):XM013886724.1、XM013889820.1、XM013886725.1、XM013886720.1；甘藍(Brassica oleracea)：XM013780571.1、EF484879.1、XM013747937.1、XM013747935.1、XM013747933.1；芥菜( Brassica juncea)：DQ359126.1；蘿卜( Raphanus sativus):、XM018603280.1、XM018603273.1、XM018611175.1；薺藍(Camelina sativa)：XM010518038.2；薺菜(Capsella-rubella):XM006302428.1；擬南芥(Arabidopsis lyrata)：XM002878094.2圖2 菜心TDF同源序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of TDF homologous sequences from plants

3.2 cDNA-AFLP轉錄圖譜分析

EST-SSR是共顯性標記，來自于轉錄區，具有通用性好、保守性高及連鎖相關性狀等特點[18-19]，其對菜心抗小菜蛾F2群體的檢測結果應該更符合群體特征[15]，但是因為開發的菜心EST-SSR標記較少，未能揭示內含子、調控序列等基因表達調控信息，在高密度圖譜構建和基因克隆方面還有不足。為此，本研究利用330個cDNA-AFLP標記構建對菜心抗小菜蛾的轉錄圖譜，但只有42個位點定位在 5個連鎖群上，一共有18個偏分離位點，偏分離比例為42.86 %，偏向母本的比例為26.19 %，偏向父本的比例為16.67 %。與已有的菜心、白菜和甘藍型油菜的研究相比，本研究的菜心偏分離比例居中。在玉米[26]、水稻[27]、高粱[28]、大豆[29]等作物的分子標記連鎖群上都發現了偏分離的熱點區域。熱點區域中的偏分離標記大多偏向父本，表明雄配子體的選擇可能是偏分離形成的主要原因，在水稻中和玉米中定位了不同的配子體基因[30]。在大豆重組自交系、甘藍型油菜重組自交系和DH 群體中則發現多數的偏分離標記偏向母本[25,29,31]。本研究利用F2分離群體發現標記偏向母本的比例較高，與利用菜心RIL群體得到的偏向父本的結果不同[20]，這是否與群體或標記的不同有關，或是母本對偏分離的影響較大還需要繼續研究。不同標記類型得到的偏分離比例和程度差異很大，偏分離位點對共顯性標記間重組率估計的影響小于顯性標記[32]，AFLP 和RAPD 標記經常在著絲粒和異染色質附近區域存在聚集現象，從而造成連鎖群上出現很大的空隙[33-34]，這也可能是本研究利用cDNA-AFLP標記構建的連鎖群上標記分布不均勻，成簇分布和具有較大的斷裂原因。本研究結果也意味著對于遺傳偏分離比例較高的菜心，可能將cDNA-AFLP標記和SSR標記結合會構建出高精度的圖譜。顯著的偏分離現象，可能對抗/感株系的篩選也具有指導意義。

3.3 抗蟲相關基因分析

β-1,3-葡聚糖酶是一類以基因家族形式存在的重要病程相關蛋白(Pathogenesis-related proteins, PR, PR2)，是植物的重要防御基因。GW775571.1是從生長3周的白菜葉片獲得的表達序列標簽，為白菜霜霉病誘導的防御相關基因cDNA 5端 mRNA序列，全長222 bp，在白菜和小麥抗病防御反應中發揮作用[35-38]。此外，GW775571.1與Brassicarapaglucanendo-1,3-beta-glucosidase(XM_009140795.2)和Brassicarapasubsp.chinensisBcGlugeneforbeta-1,3-glucanase(AB325668.1)的同源性達100.00 %，與Brassicarapabeta-1,3-glucanase(KY363864.1)同源性達99 %，與擬南芥Arabidopsislyratasubsp.lyrataglucanendo-1,3-beta-glucosidase(XM_002878094.2)同源性為84 %。與甘藍型油菜、甘藍、蘿卜等也具有高度同源基因(圖2)。與擬南芥(Arabidopsisthaliana)putative beta-glucosidase高度同源[16]。本研究克隆的TDF5-1-1差異表達片段與白菜病程相關蛋白2基因GW775571.1同源性高達98 %，意味著抗蟲性相關基因可能與抗病性基因有關，但還需要后續實驗驗證。

cDNA-AFLP分子標記來自mRNA，單拷貝和多拷貝都有[5]，本研究8個差異片段(TDF4-2-1、TDF4-3-1、TDF5-2-1、TDF5-3-1、TDF6-1-1-1、TDF6-1-2-1、TDF6-2-2-1和TDF6-2-1-1)均是大白菜花蕾敗育相關基因(GR308173.1)相關序列[39]，是否是克隆的多拷貝片段還有待繼續研究，花蕾敗育相關基因是否參與抗蟲性有關還未見報道，TDF4-1-1 與EX106546.1高度同源，功能未知。

4 結 論

本研究利用cDNA-AFLP 分析菜心抗蟲性，利用42個位點構建了包含5個連鎖群的cDNA-AFLP轉錄圖譜，獲得1個TDF與白菜防御相關基因GW775571.1高度同源，8個TDF與大白菜花蕾敗育相關基因GR308173.1高度同源，1個TDF與功能未知基因EX106546.1高度同源。本研究初步揭示了轉錄組水平上抗蟲菜心群體的連鎖遺傳規律及抗蟲性的分子機制，為高密度遺傳圖譜構建及抗蟲基因全長的克隆和驗證、抗/感材料的篩選和進化研究具有指導意義提供理論指導。