基于ITS2 DNA條形碼的苞葉雪蓮分子鑒定

郝豆豆，張勇群，雷 鳴，拉 多

(1.西藏自治區(qū)人民政府駐成都辦事處醫(yī)院，四川 成都 610000；2.西藏大學，西藏 拉薩 850000)

【研究意義】苞葉雪蓮(Saussureaobvallata)是菊科、風毛菊屬多年生草本植物，高20～50 cm，生長在海拔4500～5500 m的高山流石灘、石山、陰面石山[1]。產(chǎn)于青海、西藏、四川西部、云南西北部，其藥性苦寒，具有抗炎鎮(zhèn)痛、清熱解毒、舒經(jīng)活絡(luò)的作用[2]，在中醫(yī)中用于治療中風、麻風、癲狂等疾病[3]。【前人的研究進展】由于苞葉雪蓮生長于高原天然高輻射環(huán)境中，所以植株內(nèi)可能存在天然抗輻射物質(zhì)，有研究表明苞葉雪蓮有明顯的防輻射作用，能夠改善免疫功能[4]；從苞葉雪蓮中提取的木質(zhì)素成分牛蒡苷元(ARC)和牛蒡苷(ARC-G)這2種化合物對由DMBA和TPA誘導產(chǎn)生的腫瘤有良好的抑制效應[5]；苞葉雪蓮還含有豐富的K、Zn、Cu元素，其中尤以Zn、Cu遠高于一般植物性食物，對生物膜脂質(zhì)過氧化損害具有穩(wěn)定作用。目前很多學者致力于將這些高效低毒的天然抗輻射藥物運用到癌癥治療中，試圖進一步改進癌癥療效[6]。【本研究切入點】風毛菊屬(Saussurea)植物中做雪蓮花用藥的有20種以上，它們的產(chǎn)地和藥用功效各不相同，但是市場上已形成了該屬數(shù)種植物冠以“雪蓮花”互用的局面，市場上出售的苞葉雪蓮藥材及其成方制劑的質(zhì)量得不到保證，有很多為替代品[7]。雪蓮花藥材市場情況混亂，執(zhí)行藥材品質(zhì)評價工作較為困難。目前該藥材的鑒別有性狀鑒別、顯微鑒別、薄層色譜鑒別和高效液相色譜等方法[8]。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)很快被應用到物種鑒定中，因其能準確、快速鑒定物種，在物種鑒定中有很大優(yōu)勢，ITS2序列為核糖體DNA第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，有足夠的變異性來區(qū)分密切相關(guān)的物種[9]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文對苞葉雪蓮的ITS2序列進行分析，旨在為其近緣物種建立基于ITS2的DNA條形碼的鑒別方法，也為其在市場上的質(zhì)量控制和安全用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

苞葉雪蓮采自西藏林芝色季拉山(海拔4677 m，29°37′04″N；94°39′01″E)，苞葉雪蓮由西藏大學理學院拉多教授(研究方向為植物學與植物生態(tài)學)鑒定，將樣品保存在裝有硅膠的自封袋里，迅速脫水，干燥保存。苞葉雪蓮的近緣物種序列來源于GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.2 苞葉雪蓮DNA提取、PCR擴增和測序

用高鹽低pH法[10]提取苞葉雪蓮總DNA；采用核基因ITS片段擴増[11]，正向引物序列為：ATGCGATACTTGGTGTGAAT，反向引物序列為：GACGCTTCTCCAGACTACAAT；PCR擴增程序為:94 ℃預變性5 min；進入PCR循環(huán)，94 ℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.3 序列比對

用Bioedit軟件進行多序列比對，用DNAstar軟件計算GC含量。

1.4 系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建

將全部序列用MEGA(Molecular Evolutionany Genetics Analysis)6.0軟件分析，基于鄰接(Neighbor Joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，基于K2P雙參數(shù)模型利用Bootstrap法1000次重復檢驗各分支的支持率。

1.5 ITS2序列二級結(jié)構(gòu)預測

ITS序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和28S區(qū)段即可獲得ITS2間隔區(qū)序列[12]；根據(jù)Koetschan等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de./)預測ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)[13]。用Image J軟件計算ITS2序列二級結(jié)構(gòu)的各區(qū)之間的夾角。

2 結(jié)果與分析

2.1 苞葉雪蓮的ITS序列測定

用紫外分光光度計測定苞葉雪蓮的濃度，為2520 μg/mL，A260/280=1.70，A260/230=1.85。說明用高鹽低pH法提取的苞葉雪蓮總DNA濃度高，蛋白質(zhì)、糖類、小分子物質(zhì)等基本去除干凈，DNA的質(zhì)量滿足后續(xù)的分子生物實驗。測序后的序列去除兩端信號不穩(wěn)定的序列，最終的序列長度為400 bp，GC含量( %)為58.44。去除兩端的5.8S和28S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列，長度為217 bp。

2.2 基于ITS2序列苞葉雪蓮同屬樣本多序列比對分析

苞葉雪蓮屬于風毛菊屬中的珍貴野生種，對與苞葉雪蓮同屬的16個風毛菊屬野生種(表1)的ITS2序列進行了同源比對(圖1)，比對后17個風毛菊屬的野生物種一致序列長度為224 bp，共有31個變異位點。苞葉雪蓮、鼠麯雪兔子、雪蓮花、污花風毛菊、橢圓風毛菊、顯鞘風毛菊、重齒風毛菊和高山風毛菊在1～3堿基位點序列為CGC,而褐花雪蓮、球花雪蓮、東俄洛風毛菊、唐古特雪蓮、長葉雪蓮、禾葉風毛菊、柱莖風毛菊和綿頭雪兔子在該位點出現(xiàn)缺失。在第44位，其余物種都為T，只有苞葉雪蓮突變?yōu)镃，此位點應是將苞葉雪蓮與其他物種進行區(qū)分的一個重要位點。苞葉雪蓮等風毛菊屬植物有2個POLY結(jié)構(gòu)(≥5個單堿基重復)，13～17位點為PloyC，94～98位點為PloyA，個別植物有變異，鉆葉風毛菊第16位突變?yōu)锳，綿頭雪兔子第16位缺失，鼠麯雪兔子第98位突變?yōu)門。在139位點鉆葉風毛菊、球花雪蓮、顯鞘風毛菊、柱莖風毛菊、污花風毛菊和重齒風毛菊有插入堿基事件。在第173位，其余物種均為G，只有苞葉雪蓮和高山風毛菊突變?yōu)锳。在其它的變異位點處，各物種分別有突變或缺失，可以將各樣本區(qū)分開來。

表1 苞葉雪蓮及16種其它風毛菊屬野生種信息

圖1 苞葉雪蓮同屬物種的ITS2序列比對Fig.1 ITS2 sequence alignment between Saussurea involucrata and species of the same genus

2.3 苞葉雪蓮系統(tǒng)進化樹分析

為了進一步分析利用ITS2序列對苞葉雪蓮(風毛菊屬)與菊科其它屬之間進行系統(tǒng)發(fā)育分析的可能性，分析了風毛菊屬(Saussurea)、牛蒡?qū)?Arctium)、漏蘆屬(Rhaponticum)、紅花屬(Carthamus)、矢車菊屬(Centaurea)、藍花矢車菊屬(Cyanus)、倉木屬(Atractylodes)、刺苞菊屬(Carlina)、飛廉屬(Carduus)、薊屬(Cirsium)共10個屬30個種(表2)的進化關(guān)系。

表2 苞葉雪蓮近緣物種信息

分支上的數(shù)值僅顯示自展支持率≥50 %The number on the branch shows only the bootstrap value is greater than 50 %圖2 苞葉雪蓮系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of Saussurea involucrata

根據(jù)ITS2序列對所有樣本構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹(圖2)。可見17個風毛菊屬野生種共同形成了單個大的分支，支持率為99 %；牛蒡?qū)?Arctium)、藍花矢車菊屬(Cyanus)、紅花屬(Carthamus)、矢車菊屬(Centaurea)、漏蘆屬(Rhaponticum)與風毛菊屬聚為一個大支，支持率為68 %，說明親緣關(guān)系較近；其余的屬聚為另一個大支，說明與風毛菊屬親緣關(guān)系較遠；薊屬(Cirsium)聚為一支，支持率為96 %；相同屬物種聚類為一小支說明分類的準確性，充分說明ITS2作為苞葉雪蓮DNA條形碼序列的合理性。

2.4 苞葉雪蓮ITS2序列二級結(jié)構(gòu)分析

選取與苞葉雪蓮同屬的2個物種[鼠麯雪兔子和球花雪蓮(圖3B、C)]與與其同科不同屬的3個物種[紅花、牛蒡和飛廉(圖3D、E、F)]，進行二級結(jié)構(gòu)比較。

分析苞葉雪蓮與其同屬物種的ITS2二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，2區(qū)和4區(qū)結(jié)構(gòu)相同，說明是保守區(qū)域；A和B的1區(qū)結(jié)構(gòu)也相同，A和C的1區(qū)結(jié)構(gòu)僅僅是環(huán)與環(huán)的距離存在微小差異；A、B、C的第3區(qū)結(jié)構(gòu)互不相同，表現(xiàn)在A與B的莖環(huán)數(shù)不同，A與C莖環(huán)距離不同；從各區(qū)夾角(表3)來看，3個物種的各區(qū)夾角均有差異，說明可以通過預測二級結(jié)構(gòu)，根據(jù)物種二級結(jié)構(gòu)的獨特性，將其與其近緣物種進行區(qū)分。苞葉雪蓮與其他不同屬物種的ITS2二級結(jié)構(gòu)相比較，1區(qū)和3區(qū)的莖環(huán)數(shù)量、環(huán)與環(huán)的距離及環(huán)的大小差異較大，2區(qū)和4區(qū)相對差異較小；與苞葉雪蓮不同屬的物種，各區(qū)夾角也有明顯差異，所以二級結(jié)構(gòu)能夠明確區(qū)分與苞葉雪蓮不同屬的物種。

3 討 論

苞葉雪蓮在我國藏藥材中占有重要的地位，但是由于苞葉雪蓮種群更替慢，過度采挖導致物種數(shù)目越來越少，植物種群一但被破壞，很難自我恢復。苞葉雪蓮在市場上得不到充足的供給，就出現(xiàn)了各種假冒偽劣、以次充好的替代品，藥材質(zhì)量得不到保證，質(zhì)量監(jiān)管困難重重。ITS2序列作為中藥材鑒定的DNA條形碼，不受植物形態(tài)特征的影響，直接從分子水平上對植物進行區(qū)分，不僅鑒定方法簡單，并且鑒定準確率高，在包括植物、動物、真核微生物等生物物種鑒定領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢，越來越受到學者的重視[14]。

A：苞葉雪蓮；B：鼠麯雪兔子；C：球花雪蓮；D：紅花；E：牛蒡；F：飛廉A: Saussurea involucrata; B: Saussurea gnaphalodes; C: Saussurea globosa; D: Carthamus tinctorius; E: Arctium lappa; F: Carduus nutans圖3 苞葉雪蓮等6種菊科野生種的ITS2序列二級結(jié)構(gòu)預測Fig.3 Secondary structure prediction of ITS2 sequences of 6 wild species of Compositae

物種各區(qū)夾角(°)1234A34.39269.060112.620143.041B30.18463.939129.250137.513C35.16772.016122.082130.236D31.33960.402123.300145.456E32.90566.801113.629147.031F32.20364.344124.071139.627

注：A：苞葉雪蓮；B：鼠麯雪兔子；C：球花雪蓮；D：紅花；E：牛蒡；F：飛廉。 Note: A:Saussureainvolucrata; B:Saussureagnaphalodes; C:Saussureaglobosa; D:Carthamustinctorius; E:Arctiumlappa; F:Carduusnutans.

4 結(jié) 論

本文將苞葉雪蓮和來源于GenBank數(shù)據(jù)庫樣本的ITS2序列進行了分析，結(jié)果顯示，苞葉雪蓮與其同屬和近緣屬的ITS2序列組成、ITS2二級結(jié)構(gòu)、分子進化樹聚類這幾個層面均表明，ITS2序列能夠很好對物種與其近緣物種進行分子鑒定。由于GenBank數(shù)據(jù)庫中集合了全球各個不同地方的研究學者所提交的研究成果，樣本來源地非常廣泛，所以數(shù)據(jù)具有全方位性，結(jié)果比較可靠。有研究報道，對ITS2二級結(jié)構(gòu)進行分析可以解決更高級分類時多序列比對困難的問題[15-16]。總之，找到一個快速、準確的識別和鑒定植物的方法很有必要，ITS2序列作為DNA條形碼可方便快捷地鑒別苞葉雪蓮及其代用品，為其種質(zhì)資源鑒定及臨床安全用藥提供了重要分子依據(jù)。