三肽脯氨酸對大鼠蛛網膜下腔出血后腦神經細胞凋亡的影響

陳朝暉 洪溪屏 蘭頻 潘鋒

細胞凋亡作為一種在凋亡相關基因調控下發生的程序性死亡過程，在蛛網膜下腔出血（SAH）后腦損傷過程中扮演著重要角色，凋亡神經細胞可通過釋放諸如TNF和IL等炎性因子導致周圍正常細胞壞死，因此，抑制SAH后腦神經細胞凋亡被認為是SAH治療策略中的重要部分[1]。AMP激活的蛋白激酶（AMP-activatedpro-teinkinase，AMPK）通路是細胞能量代謝及氧化還原狀態的雙重超敏感受器，在SAH所誘導的早期腦損傷中發揮了重要作用[2]。三肽脯氨酸（tristetraprolin，TTP）作為串聯鋅指蛋白半胱氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-組氨酸（CCCH）級的成員，可在轉錄后水平調控許多促炎因子和生長因子，如 IL-6、IL-33、NF-κB和HIF-α等[3]，從而在調控細胞生長、凋亡和炎癥反應等病理生理反應過程中發揮著重要作用[4]。但TTP對SAH后腦神經細胞凋亡的影響尚不明確，因此，筆者通過建立大鼠SAH模型，研究TTP對大鼠SAH后腦神經細胞凋亡的影響及其可能機制，為臨床治療SAH提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 細胞蛋白提取試劑盒購自日本TaKaRa株式會社；大鼠TTP基因過表達質粒及對照質粒購自上海吉凱基因化學公司；TTP小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）質粒及對照質粒購自上海銳博生物公司；Tunel試劑盒購自瑞士Roche公司；腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK） 激動劑 5-氨基咪唑-4-甲酰胺-β-D-呋喃糖苷（5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside，AICAR）購自美國 Sigma公司；TTP、Bax、Bcl-2和Caspase-3和β-actin抗體購自美國Epitomics公司；AMPK、LKB1、p-AMPK 和 p-LKB1 抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 大鼠SAH模型建立 健康清潔級成年雄性SD大鼠120只，體重290～340g，購自中科院上海動物實驗中心，所有動物實驗均依照“NIH Guidelines of Care and Use of Laboratory Animals（2011）”標準進行，動物飼養于18～24℃恒溫恒濕環境中，12h/12h光暗周期，實驗動物均自由進食水。參考Bederson等[5]的血管內穿刺法制作大鼠SAH模型，應用10%水合氯醛對大鼠進行腹腔麻醉，將大鼠置于試驗臺上固定，頸部皮膚備皮和消毒后于頸部正中縱向切開，顯露頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，用血管夾臨時阻斷頸總動脈和頸內動脈，在頸外動脈行一小切口，自切口將導管和鎢絲插入頸外動脈，將導管緩慢推進至大腦前動脈和中動脈分叉處，將鎢絲繼續推進1～2mm，穿破動脈從而建立SAH模型。手術結束后，將大鼠置于恒溫箱內并標記。

1.3 實驗設計、分組及給藥方式 將120只大鼠隨機分為假手術（Sham）組（進行SAH模型建立相似手術操作，但不穿破動脈）、SAH組、TTP過表達對照（SAH+Vector）組、TTP過表達（SAH+TTP）組、TTP干擾對照（SAH+NC）組、TTP小干擾（SAH+siTTP）組、SAH+AICAR組和SAH+AICAR+TTP組，每組15只。所有藥物均在SAH建模前24h通過立體定向儀經右側側腦室注射，注射坐標為：向后1.0mm，右側旁開1.0mm，深度為4.5mm，注射完成后繼續留針5min。Sham組大鼠注射0.9%氯化鈉注射液10μl，SAH 組大鼠注射 0.9%氯化鈉注射液 10μl，SAH+Vector組大鼠注射TTP過表達對照質粒10μl（5nmol/μl），SAH+TTP組大鼠注射TTP過表達質粒10μl（5nmol/μl），SAH+NC組大鼠注射TTPsiRNA對照質粒10μl（5nmol/μl），SAH+siTTP 組 大 鼠 注 射 TTP siRNA10μl（5nmol/μl），SAH+AICAR組大鼠注射AICAR 10μl（5μg/μl），SAH+AICAR+TTP組大鼠注射AICAR+TTP過表達質粒10μl（5μg/μl）。各組大鼠建模后24h經脊椎脫臼法處死后取右側大腦半球腦組織進行下一步實驗（實驗過程中，Sham組大鼠無一只死亡，SAH組死亡3只，SAH+Vector組死亡2只，SAH+NC組死亡2只，SAH+TTP組死亡3只，SAH+siTTP組死亡3只，SAH+AICAR組死亡2只，SAH+AICAR+TTP組死亡4只）。

1.4 Tunel法檢測腦神經細胞凋亡率 各組大鼠腦組織石蠟切片經脫蠟水化，每組標本按Tunel試劑盒說明書操作，每個樣本滴加 50μl Tunel反應混合液，置于濕盒中37℃孵育1h，再添加DAPI核染，置于熒光顯微鏡（OLYMPUS,BX51TF）下選擇視野拍片。神經細胞核染為藍色即是Tunel陽性細胞，在400倍熒光顯微鏡下，隨機選取5個視野，共計數200個細胞計算鏡下陽性細胞所占比例。

1.5 Western blot檢測腦組織蛋白的表達 大鼠腦組織加入細胞裂解液中，置于冰上反應30min，再在4°C條件下12 000r/min離心20min，收集上清液后使用BCA蛋白檢測試劑盒對蛋白質濃度進行定量分析。蛋白質樣品（30μg）使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行后轉移到0.45 μm的硝酸纖維素膜上，并使用5%脫脂奶粉于4℃下孵育過夜，該膜在4°C與一抗 [TTP（1 ∶500）、Bax（1 ∶1 000）、Bcl-2（1 ∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）、AMPK（1∶2 000）、LKB1（1∶1 000）、p-AMPK（1∶1 000）和 p-LKB1（1∶2 000）]在室溫下反應30min后，在室溫下與二抗再次孵育1h，ECL反應、曝光、顯影。使用美國Nikon Spot圖像采集處理系統采集圖像，圖像經Image-ProPlus 5.0專業圖像分析軟件分析條帶并測量累積光密度值，以目的蛋白條帶累積光密度值與β-actin條帶累積光密度值之比表示。

1.6 統計學處理 應用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TTP對大鼠SAH后腦神經細胞凋亡的影響 見圖1。SAH組大鼠腦神經細胞凋亡率較Sham組明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.01）；與SAH+Vector組比較，SAH+TTP組中腦神經細胞凋亡率顯著減少，差異有統計學意義（P＜0.01）；下調TTP在大鼠腦組織中的表達可增加大鼠SAH后腦神經細胞凋亡率，SAH+siTTP組和SAH+NC組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 TTP對大鼠SAH后腦神經細胞凋亡的影響（*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 TTP在SAH大鼠中的表達 與Sham組比較，SAH組腦組織中TTP的表達顯著下調，差異有統計學意義（P＜0.01）；與 SAH+Vector組比較，SAH+TTP組腦組織中TTP蛋白的表達明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖 2a、表 1；SAH+siTTP 組腦組織中 TTP 蛋白的表達較SAH+NC組明顯下調，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖 2b、表 2。

圖2 TTP過表達質粒及TTP siRNA對大鼠腦神經細胞中TTP表達的影響

表1 TTP過表達質粒對大鼠腦神經細胞中TTP表達的影響

表2 siTTP對大鼠腦神經細胞中TTP表達的影響

2.3 TTP對大鼠SAH后凋亡相關蛋白表達的影響 SAH建模24h后大鼠腦組織中Bax和Caspase-3的表達明顯上調，而Bcl-2表達下調，與Sham組比較差異均有統計學意義（均P＜0.01），見圖3a、表3；上調TTP在腦組織中的表達后可顯著上調Bcl-2的表達，同時抑制Bax和Caspase-3的表達；SAH+siTTP組大鼠腦組織中Bax和Caspase-3的表達較SAH+NC組均顯著上調，而Bcl-2表達下調（P＜0.05），見圖 3b、表 4。

SAH建模24h后大鼠腦組織中p-AMPK和p-LKB1的表達明顯上調，與Sham組比較差異有統計學意義；上調TTP在腦組織中的表達可抑制p-AMPK和p-LKB1的表達，SAH+TTP組與SAH+Vector組比較，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖 3c、表 5；AMPK 激動劑AICAR可顯著誘導p-AMPK和Caspase-3在大鼠腦組織中的表達，并抑制TTP的表達，同時AICAR可逆轉TTP對p-AMPK和Caspase-3的表達抑制作用，p-AMPK和Caspase-3在SAH+AICAR+TTP組中的表達均高于SAH+TTP組中的表達，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖 3d、表 6。

圖3 TTP對大鼠SAH后腦細胞凋亡相關蛋白表達的影響

表3 TTP過表達質粒對Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響

表4 siTTP后對Bax、Caspase-3和Bcl-2表達的影響

表5 TTP過表達質粒對p-AMPK和p-LKB1表達的影響

表6 AICAR對TTP、p-AMPK和Caspase-3表達的影響

3 討論

SAH作為一類致死率和致殘率極高的神經外科疾病，可導致腦細胞以炎性壞死、凋亡和自噬3種形式死亡，從而引起腦水腫、腦血管痙攣、炎性反應、血腦屏障破壞和肺水腫等一系列并發癥[1]。研究表明SAH后誘發的早期腦損傷是導致患者死亡及神經功能障礙的最主要原因，且神經功能缺損程度與腦組織損傷過程中線粒體功能受損、能量代謝障礙和自由基的集聚直接相關[2]。細胞凋亡作為一種細胞程序性死亡方式，在SAH后早期腦損傷中扮演著重要角色，凋亡細胞可通過釋放諸如TNF-α和IL-6等炎性因子從而影響周圍正常細胞發生壞死。有研究表明，干預SAH大鼠海馬區神經細胞凋亡，可有效改善SAH大鼠預后[6]。因此，抑制SAH后腦神經細胞凋亡被認為是SAH治療策略中重要的一環[7-8]。目前，大鼠SAH模型的建立有枕大池注血法、視交叉注血法和血管內穿刺法3種[9]，而血管內穿刺法更適合研究大鼠SAH后早期腦損傷，為此，本研究通過血管內穿刺法建立大鼠SAH模型，并且觀察到造模后大鼠腦神經細胞凋亡明顯增加，與既往研究相似[10]。

TTP首次發現于ARE與TNF-α mRNA的交聯中[3]，目前關于TTP作為一種mRNA破壞因子最明確的證據來自于對TTP敲除大鼠的觀察，TNF-α mRNA在這種大鼠的巨噬細胞中表達顯著上調，從而導致血液循環中TNF-α含量增加，進而引起全身炎癥反應的多種癥狀[4]；另外在TTP敲除小鼠中也觀察到諸如惡液質、侵蝕性關節炎、皮膚炎、結膜炎和腎小球腎炎等多種炎癥反應[11]；另外改變TTP在機體中的表達對諸如類風濕性關節炎、全身性紅斑狼瘡和潰瘍性結腸炎等疾病的發生和嚴重程度起到非常重要的作用[12-13]。但目前尚未有TTP與SAH的相關性研究報道，本研究發現，TTP在SAH造模后表達下調，表明TTP有可能作為SAH后腦損傷發生的早期預測因子及治療靶點。為進一步研究TTP在大鼠SAH中的作用，筆者通過經大鼠腦室注射TTP過表達質?；騎TP siRNA質粒的方法從而影響大鼠腦組織中TTP的表達，并通過Tunel法分析TTP在SAH后腦神經細胞凋亡中的作用，本次研究首次觀察到大鼠注射TTP過表達質粒后可有效減少SAH后誘發的腦神經細胞凋亡，同時抑制Caspase-3的表達并降低Bax/Bcl-2比值，而注射TTP siRNA質粒后可起到相反的作用，從而表明抑制腦神經細胞凋亡在TTP發揮SAH后腦神經細胞保護作用中發揮了一定作用，而降低Bax/Bcl-2比值在TTP發揮腦神經細胞保護作用中可能起到一定作用。

研究表明，AMPK作為一種異源三聚體蛋白，由α催化亞基和β、γ調節亞基組成，AMPK可通過調節細胞的能量及代謝平衡，從而對細胞的生長及增殖產生調控作用，激活后的AMPK可通過調控mTOR、P13K和LKB1等一些在細胞能量代謝過程中的關鍵蛋白激酶，從而影響細胞凋亡[14-15]。在本研究中，SAH可顯著上調AMPK及其下游因子LKB1的磷酸化水平，而上調TTP可抑制p-AMPK在腦組織中的表達，但TTP和AMPK在大鼠SAH過程中的互為因果關系尚不明確。為進一步明確AMPK通路在TTP抑制SAH后腦神經細胞凋亡中的作用，本研究將AMPK的特異性激活劑AICAR注射至大鼠腦室中，觀察到單獨應用AICAR可下調TTP及Caspase-3的表達，同時在AICAR存在的情況下，TTP對Caspase-3的下調作用也明顯減弱，從而進一步表明抑制AMPK通路在TTP減少腦神經細胞凋亡過程中發揮著主要調控的作用。

綜上所述，本研究表明TTP可有效保護大鼠SAH后腦神經細胞凋亡的發生，其抑制腦神經細胞凋亡的機制與抑制AMPK信號通路有關，從而為臨床SAH治療提供一個新的作用靶點，在揭示SAH的發病機制及治療上具有一定積極意義。