Fe²⁺急性脅迫對斑尾復鰕虎魚組織結構的影響

宮春光 殷蕊 孫桂清 于清海 石艷潔 張建業

摘 要：為探究重金屬Fe2+對斑尾復鰕虎魚（Synechogobius hasta）組織結構的影響，在水溫16.5 ℃、鹽度30‰、pH 8.0的環境下，進行了Fe2+對斑尾復鰕虎魚的急性脅迫實驗。結果表明，斑尾復鰕虎魚對Fe2+異常敏感，最小濃度組5 mg/L的平均死亡時間僅為5.2 h；在各種組織器官中，Fe2+對斑尾復鰕虎魚的鰓組織損傷最為明顯，會造成鰓絲充血，鰓小片上皮細胞增生，從而嚴重阻礙魚的呼吸機能。

關鍵詞：斑尾復鰕虎魚（Synechogobius hasta）；Fe2+；急性脅迫；組織結構

斑尾復鰕虎魚（Synechogobius hasta），與矛尾復鰕虎魚同物異名，隸屬鱸形總目（Perciformes），鰕虎魚亞目（Gobioidei）鰕虎魚科（Gobiidae）鰕虎魚亞科（Gobiinae），復鰕虎魚屬（Synechogobius）[1]。在我國黃渤海、東海、臺灣海峽及周邊半咸水水域均有分布，屬底棲魚類，多棲息于沙泥底質。斑尾復鰕虎魚生命周期僅一冬齡，親魚早春4月產卵后大部分死亡，捕獲的野生個體大小不等，通常在50～200 g/尾，經濟價值不高，屬沿海小型雜魚[2-3]，由于其具有攝食蝦苗的習性，因此在沿海對蝦養殖中往往被作為敵害生物對待，通過蝦池進水時的密網（80目篩絹）過濾或進水后使用茶粕予以清除。

國家蝦產業體系近幾年的研究結果表明，利用生物防控技術對某些病毒性蝦病的防控能夠取得較好效果，通過在蝦池中混養魚類，利用魚類攝食病死蝦以減少蝦病的傳播。以往所公布的混養魚類均為規模化人工養殖品種，人們對這些品種的研究相對較多，對不同品種的生態環境適應性了解較多，容易處理混養中的各種問題。在國家蝦產業體系以往所列的混養魚類中并無斑尾復鰕虎魚，但2017年河北省對蝦養殖生產實踐表明，該魚的混養效果在各種混養魚類中表現最好，尤其是在中國對蝦的養殖中。在每hm2放養600尾左右的斑尾復鰕虎魚時能夠取得較理想的效果，即攝食病死蝦的比例超過70%（攝食健康蝦的比例低于30%），同時基本控制了病毒性蝦病（尤其是白斑綜合征（WSD））的流行，斑尾復鰕虎魚未來有望成為重要的對蝦養殖生物防控混養魚類。而目前該魚尚未有人工規模化養殖，市場上的商品多來自海捕和蝦池捕撈，人們對其生態環境要求及各種環境脅迫（包括藥物脅迫）對其影響缺乏了解，在養殖中環境調控和藥物使用缺乏依據，亟需進行相關研究。河北省很多蝦池利用地下咸水進行養殖，地下水中的Fe2+含量往往過高，而Fe2+對斑尾復鰕虎魚的影響尚不得而知。本實驗通過研究Fe2+急性脅迫后該魚的組織結構變化，以闡明Fe2+對斑尾復鰕虎魚的影響，豐富該魚環境脅迫反應數據庫，為養殖實踐提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用斑尾復鰕虎魚捕撈自河北省黃驊地區沿海，平均全長34.05 cm，平均體重142.94 g；實驗水槽為體積30 L水族箱；實驗用水為海水晶+曝氣1 d的自來水配制的人工海水；添加的Fe2+使用硫酸亞鐵分析純。制作切片的各種試劑為常規試劑。

1.2 實驗方法

斑尾復鰕虎魚在正式實驗開始前暫養2 d，選用規格相近、體色正常、體表無外傷、健壯的個體用于脅迫實驗；實驗用水水溫16.5 ℃、鹽度30‰、pH 8.0；在水族箱中加入20 L人工海水，以Fe2+為計算單位加入硫酸亞鐵，濃度設置為5、50和500 mg/L，每組設3個平行，設一個對照組；配制好藥液后在每個箱中放入2條實驗魚，不充氣，靜水實驗。實驗期間不投喂。

實驗開始后觀察不同濃度組實驗魚的游動情況、呼吸頻率、黏液分泌等表征；實驗魚一旦出現死亡，立即解剖，取鰓、肝臟、腎臟和脾臟，Bouin氏液固定，經自來水沖洗、梯度酒精脫水、透明、透蠟和石蠟包埋等步驟后進行切片，切片厚度5 μm；采用蘇木精-伊紅染色法（H. E）染色，BK5000顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 實驗結果

2.1.1 實驗魚表征 硫酸亞鐵加入水中后，實驗用水很快變成紅褐色，0.5 h后逐漸產生紅褐色沉淀，藥物濃度越大越明顯。實驗魚放入水中后，除開始時有短暫應激反應外，基本沒有異常表現，比較安靜，僅胸鰭微微擺動，與對照組相同。10 min后500 mg/L濃度組實驗魚開始急速游動，30 min后逐漸趨于平靜（麻痹）；50 mg/L 濃度組在實驗進行到2 h時出現5 min左右的劇烈游動，其后反應平靜；5 mg/L濃度組實驗魚始終處于平靜狀態。500 mg/L濃度組實驗魚在實驗開始1.5 h后體色變淺、發白，50 mg/L濃度組實驗魚3 h后體色開始發白，5 mg/L濃度組實驗魚體色始終無變化。實驗開始0.5 h后，所有加入Fe2+實驗組的實驗魚黏液分泌開始增多，表現為水中出現絮狀物，藥物濃度越高絮狀物越多。實驗開始0.5 h時，對照組魚鰓蓋張合次數為平均27次/min，5 mg/L濃度組為平均32次/min，50 mg/L濃度組為平均33次/min，500 mg/L濃度組為平均52次/min；實驗進行2 h時，對照組魚鰓蓋張合次數為平均26次/min，5 mg/L濃度組為平均34次/min，50 mg/L組為平均41次/min，500 mg/L組為平均20次/min；實驗進行2.5 h，500 mg/L濃度組開始有死亡出現，該濃度組魚鰓蓋張合次數平均僅為9次/min，對照組魚鰓蓋張合次數為27次/min，5 mg/L濃度組為38次/min，50 mg/L濃度組為平均22次/min。

500 mg/L濃度組實驗魚在實驗進行2.5 h開始陸續死亡，平均死亡時間為2.7 h；50 mg/L濃度組實驗魚在實驗進行3.2 h開始陸續死亡，平均死亡時間為3.4 h；5 mg/L濃度組實驗魚在實驗進行4.3 h開始陸續死亡，平均死亡時間為5.2 h。對照組魚沒有出現死亡。

2.1.2 Fe2+對斑尾復鰕虎魚組織結構的影響 不同濃度Fe2+急性脅迫對斑尾復鰕虎魚鰓、肝臟、腎臟和脾臟的組織結構影響見圖版I-圖版IV（見封二、封三）。

2.2 分析

硫酸亞鐵加入水中后，由于Fe2+氧化成Fe3+，水變成紅褐色并逐漸產生紅褐色沉淀，這與生產實際相同。河北省多數地區如昌黎、樂亭等地工廠化養殖牙鲆所抽取的地下水半咸水中Fe2+含量超標，地下水初始時清澈透明，但曝氣后很快變成紅褐色，停止充氣后會在池底形成厚厚一層紅褐色的沉淀。沉淀物易黏附在魚鰓上，阻礙魚的正常呼吸，在工廠化養殖持續充氣的情況下，魚不會很快死亡，但魚的體質變差，抗逆能力下降，易感染各種生物病原性疾病。

50 mg/L濃度組實驗魚在2 h內保持平靜，5 mg/L濃度組實驗魚在整個實驗過程中始終比較平靜，說明Fe2+本身并非強刺激性藥物，其作用是逐漸顯現的。硫酸亞鐵有一定收斂作用，可抑制腺細胞的分泌，使魚的黏膜細胞脫落[4]，但實驗魚卻分泌了大量黏液，這可能與實驗魚呼吸受到阻礙有關。500 mg/L濃度組的實驗魚在實驗開始10 min時開始急速游動，在實驗進行0.5 h時，鰓蓋張合次數達到52次/min（對照組則為27次/min），說明高濃度的Fe2+對斑尾復鰕虎魚的刺激較強，而當實驗進行2 h時，鰓蓋張合次數降為20次/min，實驗進行2.5 h（到了接近死亡時），鰓蓋張合次數降到了僅為9次/min，這種表現一方面符合毒物對生物的脅迫規律，即先興奮，后逐漸麻痹；另一方面也說明Fe2+對斑尾復鰕虎魚的主要影響是妨礙其呼吸功能。另外2個濃度組也有類似表現，只不過發生的時間有所區別。

本次實驗中斑尾復鰕虎魚在Fe2+脅迫下死亡較快，500 mg/L濃度組僅為2.7 h，5 mg/L濃度組也僅僅5.2 h。分析其原因可能有兩點：一是實驗魚暫養時間較短，還沒有完全適應小水體+人工海水的實驗環境，其自身處于應激狀態，對藥物的抗性較差；二是斑尾復鰕虎魚對Fe2+非常敏感。為進一步進行驗證，我們又進行了一次低濃度脅迫實驗，即將Fe2+濃度梯度設置為1、2和4 mg/L，其它實驗條件相同。實驗結果顯示，1 mg/L濃度組的平均死亡時間為25.4 h，2 mg/L濃度組為19.5 h，4 mg/L濃度組為7.5 h。低濃度脅迫實驗結果說明斑尾復鰕虎魚的確對Fe2+異常敏感。

組織切片結果顯示，Fe2+對斑尾復鰕虎魚肝臟、腎臟和脾臟的影響相對較小，5 mg/L和50 mg/L濃度組的肝臟主要表現為輕度的水泡變性，腎臟主要表現為顆粒變性，脾臟主要表現為輕度萎縮和網狀細胞偽足伸長。這些表現在魚的一般性應激中也經常存在，不能確定是Fe2+所造成的。而500 mg/L濃度組的肝臟（包括胰臟）出現了程度較深的水泡變性，腎臟的顆粒變性較嚴重，脾臟出現了一定程度的炎性細胞浸潤的現象。這些變化很難在一般的應激中出現，可以認為是高濃度Fe2+所造成的，但總體上組織變化仍屬于較輕的程度。這種結果可能是藥物浸泡時間較短，實驗魚死亡較快所造成的，但也可以確定Fe2+急性脅迫對斑尾復鰕虎魚的肝臟、腎臟和脾臟的損傷較小。

Fe2+對斑尾復鰕虎魚的鰓組織影響最大，在不同濃度組都表現得非常明顯。5 mg/L濃度組的鰓即表現出明顯的充血和上皮細胞增生的現象（圖版I-2、3）；50 mg/L濃度組的鰓小片明顯腫脹，入鰓動脈明顯擴張，鰓小片和入鰓動脈中充滿血細胞（圖版I-4）；而500 mg/L濃度組的鰓小片上皮細胞已經嚴重增生，部分鰓小片出現融合現象，有的鰓小片嚴重膨脹，體積是正常鰓小片的數倍（圖版I-5、6）。可以看出，在鰓、肝臟、腎臟和脾臟這4種組織器官中，Fe2+對鰓組織的損傷最嚴重，極大影響到了其正常的呼吸機能，是造成實驗魚死亡的主要因素。

鑒于斑尾復鰕虎魚經濟價值較低和以往作為敵害魚類的認識，人們對該魚的研究相對較少，有關其生長及繁殖的報道僅有幾篇，如羅剛等進行了矛尾復鰕虎魚性腺發育及個體繁殖力研究[5]，還進行了矛尾復鰕虎魚越冬暫養技術的研究[6]，李莉等進行了矛尾復鰕虎魚室內人工繁育實驗研究[7]，李春嶺等進行了渤海矛尾復鰕虎魚生殖力的研究[8]。有關環境（藥物）脅迫的報道也較少，僅有劉香江等研究了銅、鎘和乙酰甲胺磷對矛尾復鰕虎魚的急性毒性影響[7]，黃超等研究了水體銅和鋅暴露對矛尾復鰕虎魚肝臟脂代謝的影響[10]，稅春等研究了鹽度漸變對斑尾復鰕虎魚幼魚血清滲透壓和離子濃度及鰓絲Na+/K+–ATP酶活力的影響[11]。本項研究首次闡明了Fe2+對斑尾復鰕虎魚的組織結構影響，為進一步探討環境（藥物）脅迫對斑尾復鰕虎魚的影響機理奠定了一定基礎。研究結果可用于養殖實踐，為魚、蝦混養時藥物的使用提供一定的理論依據。

參考文獻：

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