鄰聯(lián)茴香胺分光光度法測(cè)定飼料添加劑中葡萄糖氧化酶活力

李賢

【摘要】：本方法利用葡萄糖氧化酶能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在辣根過(guò)氧化物酶的作用下氧化鄰聯(lián)茴香胺生成水和紅色產(chǎn)物，通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物吸光度變化速率用分光光度法定量計(jì)算出葡萄糖氧化酶活力。經(jīng)研究在酶濃度為0.1～0.5GODU/mL，緩沖液pH為6.0，水浴溫度為30℃的條件下，該方法具有有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

【關(guān)鍵字】：葡萄糖氧化酶活力；鄰聯(lián)茴香胺；分光光度法。

1 引言

葡萄糖氧化酶是一種綠色飼料添加劑，在飼料和畜牧生產(chǎn)中可作為抗氧化劑減緩飼料氧化變質(zhì)[1]，改善動(dòng)物腸道微生物平衡[2]，提高飼料利用率[3]，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，降低中毒反應(yīng)更在一定程度上替代抗菌藥物和抗球蟲病藥物，具有廣泛的應(yīng)用前景。

由于葡萄糖氧化酶的高度專一性，基于不同的酶活定義而建立的檢測(cè)方法主要有電化學(xué)法、測(cè)壓法、凝膠電泳法、滴定法、分光光度法和傅立葉變換紅外光譜法等[4]。電化學(xué)法、測(cè)壓法、凝膠電泳法存在方法操作復(fù)雜，要求嚴(yán)格，有很強(qiáng)的儀器依賴性；滴定法存在工作量大、樣品需要量大、人工讀數(shù)導(dǎo)致的測(cè)量精度低，尤其在混合型飼料添加劑的檢測(cè)中不能排除酸性、堿性載體干擾的缺點(diǎn)。傅立葉變換紅外光譜法是較新開(kāi)發(fā)的一種檢測(cè)方法，優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)速度快，試劑用量少。缺點(diǎn)為儀器要求和模型建立需要前期投入太大，限制了其使用范圍。因此尋找一種簡(jiǎn)便，快捷，靈敏的高的酶活力檢測(cè)方法很有意義。

本研究采用鄰聯(lián)茴香胺分光光度法測(cè)定葡糖糖酶活力。反應(yīng)機(jī)理為：葡萄糖氧化酶是一種需氧脫氫酶，能催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫和無(wú)色的還原型鄰聯(lián)茴香胺在過(guò)氧化物酶的作用下生成水和紅色的氧化型鄰聯(lián)茴香胺。在一定的pH、溫度、濃度及反應(yīng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)測(cè)定產(chǎn)物吸光度在460nm波長(zhǎng)下的變化速率定量計(jì)算出酶活力。基本反應(yīng)式為：

β-D-葡萄糖+H20+O2 δ-D-葡萄糖基-1，5-內(nèi)酯+H2O

H2O2+鄰聯(lián)茴香胺 氧化型鄰聯(lián)茴香胺+2H2O

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器設(shè)備

北京瑞利儀器有限公司UV-2600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；北京中興偉業(yè)儀器有限公司DZKW-2型電熱恒溫水浴鍋；賽多利斯科學(xué)儀器有限公司BSA224S型分析天平。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑和材料

標(biāo)示含量為40GODU/g的葡萄糖氧化酶飼料添加劑；辣根過(guò)氧化物酶（上海藍(lán)季生物）；鄰聯(lián)茴香胺（sigma，D9143）；磷酸二氫鈉（國(guó)藥試劑）；磷酸氫二鈉（國(guó)藥試劑）；葡萄糖（國(guó)藥試劑）。

1.3溶液與配制方法

1.3.1磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）：稱取16.61g磷酸二氫鈉和35.82g磷酸氫二鈉溶于無(wú)二氧化碳水中，稀釋到1000mL。

1.3.2鄰聯(lián)茴香胺甲醇溶液：稱取1g鄰聯(lián)茴香胺加在100mL甲醇中攪拌溶解備用。臨用現(xiàn)配。使用時(shí)取0.1mL加到上述緩沖液12mL中混勻。

1.3.3 葡萄糖水溶液（180g/L）：稱取18g葡萄糖加在100mL蒸餾水中攪拌溶解。

1.3.4辣根過(guò)氧化物酶溶液（0.5mg/mL）：稱取50mg辣根過(guò)氧化物酶，用10mL水溶解。

1.4測(cè)定方法

稱樣品1.000g置于500mL容量瓶中，加入蒸餾水稀釋，攪拌均勻后，定容至刻度。用快速濾紙過(guò)濾，濾液作為樣品溶液（必要時(shí)稀釋樣品溶液），取兩只潔凈試管。分別加入鄰聯(lián)茴香胺甲醇緩沖液5ml，葡萄糖溶液0.6mL，辣根過(guò)氧化物酶溶液0.2mL，置于30℃恒溫水浴中，恒溫后向其中一管中加入0.2mL蒸餾水，作為空白對(duì)照在460nm波長(zhǎng)處調(diào)零。向樣品管中加入0.2mL樣品溶液搖勻，立即在460nm波長(zhǎng)處用1cm比色皿在紫外分光光度計(jì)中讀取吸光度值，以后每隔1min測(cè)定其吸光度，連續(xù)測(cè)定5min。利用該方法測(cè)定時(shí)，酶活單位為：在pH=6.0，溫度30℃條件下，每分鐘催化氧化1μmoLβ-D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和過(guò)氧化氫的量為一個(gè)酶活單位用GODU表示。

1.5結(jié)果計(jì)算

酶活力

式中，△A460：一定時(shí)間內(nèi)460nm處吸光值變化；△t：吸光值變化對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，單位為min；11.3：消光系數(shù)；V1：樣品定容體積，單位為mL；V2：反應(yīng)體系體積，6mL；m：樣品稱樣量，單位為g；V3：移取酶液的體積，0.2mL；n：稀釋倍數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1酶液濃度范圍討論

將待測(cè)酶液稀釋分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5GODU/mL依據(jù)本實(shí)驗(yàn)2.3實(shí)驗(yàn)條件，分別測(cè)定1～4min內(nèi)平均吸光度變化值△A/△t。并以吸光度變化速率為縱坐標(biāo)，以酶液濃度為橫坐標(biāo)作圖，如圖1所示。

從圖1可以看出在酶液濃度為0.1～0.5GODU/mL的范圍內(nèi)，吸光度變化速率穩(wěn)定且線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R≥0.999。

2.2緩沖溶液pH值對(duì)酶活測(cè)定影響的討論

緩沖溶液pH值在3.0～7.0之間變化，其余條件依據(jù)本實(shí)驗(yàn)2.3要求進(jìn)行測(cè)定，研究緩沖溶液pH值對(duì)葡萄糖氧化酶活力測(cè)定的影響，如圖2所示。

從圖2可以看出，在本實(shí)驗(yàn)的緩沖溶液pH值變化范圍內(nèi)，pH值對(duì)結(jié)果的影響較為顯著。在pH為6.0時(shí)葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法測(cè)定葡萄糖氧化酶活力時(shí)采用pH=6.0的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行測(cè)定。

2.3反應(yīng)溫度對(duì)酶活力測(cè)定影響的討論

反應(yīng)溫度在25～60℃之間變化，其余條件依據(jù)本實(shí)驗(yàn)2.3要求進(jìn)行測(cè)定，研究反應(yīng)溫度對(duì)葡萄糖氧化酶活力測(cè)定的影響，如圖3所示。

從圖3可以看出，在本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)溫度變化范圍內(nèi)，在反應(yīng)溫度為30℃時(shí)葡萄糖氧化酶活力最大。因此，本方法測(cè)定葡萄糖氧化酶活力時(shí)采用30℃作為最佳反應(yīng)溫度。

2.4反應(yīng)時(shí)間的選擇

依據(jù)本實(shí)驗(yàn)2.3要求測(cè)定濃度分別為濃度為0.2GODU/mL的酶液，連續(xù)測(cè)定三次，每次連續(xù)測(cè)定6min ，分別記錄每分鐘吸光度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1中可以看出，在反應(yīng)的第1min內(nèi)，反應(yīng)速度最快且不穩(wěn)定。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在1～4min內(nèi)反應(yīng)較為穩(wěn)定，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到第5min以后反應(yīng)速率明顯減慢。因此，本方法采用反應(yīng)時(shí)間為第1min與第4min吸光度差作為兩點(diǎn)法[5]的計(jì)算數(shù)據(jù)，進(jìn)行計(jì)算葡糖糖氧化酶酶活力。

結(jié)論

綜上所述，采用鄰聯(lián)茴香胺分光光度法測(cè)定飼料添加劑中葡萄糖氧化酶活力時(shí)，在酶液濃度為0.1～0.5GODU/mL，緩沖液pH為6.0，反應(yīng)溫度為30℃，選取第4min與第1min的吸光度差依據(jù)兩點(diǎn)法計(jì)算。該方法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)迅速，精密度高，反應(yīng)系統(tǒng)較為穩(wěn)定。

【參考文獻(xiàn)】：

[1] 楊久仙，曹靖.葡萄糖氧化酶的應(yīng)用進(jìn)展，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）[J]，2013，33（1）：88-92.

[2] 宋海彬等.葡萄糖氧化酶制劑對(duì)肉雞腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和消化酶活性的影響，中國(guó)畜牧雜志[J]，2010.46（23）：56-59.

[3] 樊霞，肖志明等飼料添加劑葡萄糖氧化酶檢測(cè)方法研究進(jìn)展，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全[J]，2014（6）：21-30.

[4] 熊云霞等.葡糖糖氧化酶在畜牧業(yè)中的應(yīng)用及檢測(cè)方法研究進(jìn)展，飼料工業(yè)雜質(zhì)[J]，2016.37（4）：15-20.

[5] 李丕武，劉瑜，李瑞瑞等，兩種葡萄糖氧化酶測(cè)定方法的比較，食品工業(yè)科技[J]，2013.（12）：71-74.