葡萄酒相關酵母β-葡萄糖苷酶活性及影響因素研究

王鳳梅，張邦建，岳泰新

（包頭輕工職業技術學院 食品藥品學院，內蒙古 包頭 014035）

葡萄酒釀造是一個復雜的微生物過程，期間，酵母菌起著決定性作用。在葡萄果皮表面、葡萄園及釀酒設備表面存在著大量的酵母菌，既有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），也有大量的非釀酒酵母（non-Saccharomyces）。由于葡萄汁在釀酒前不經滅菌處理，這些酵母菌也參與發酵過程。葡萄汁中存在大量的芳香類物質如萜類（terpenes）及硫醇（thiol）等，這些芳香類物質決定著葡萄酒的香氣[1]。然而，大量的此類芳香類物質與糖類、氨基酸等物質相結合，從而失去了其獨有的香氣。相關研究表明，某些非釀酒酵母中含有特定的酶類，可水解芳香類物質與糖或氨基酸之間的糖苷鍵或碳硫鍵，從而釋放芳香類物質，提升葡萄酒的香氣與復雜性[2-3]。其中，β-葡萄糖苷酶被發現存在于多種非釀酒酵母中，可水解萜類與糖分子之間的糖苷鍵，使萜類得以釋放，增加葡萄酒的香氣[4]。基于此，釀酒酵母與一種乃至數種非釀酒酵母混合接種發酵被應用于葡萄酒釀造實踐中，在保證發酵順利進行的同時，增加并提升了葡萄酒的香氣與復雜性。LóPEZ M C等[3]研究了114株非酵母菌，并從中篩選出膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus），4個菌株都有很高的葡糖苷酶和木糖苷酶活性。研究人員還分別用4株酵母菌處理葡萄酒，使其萜烯含量增加了1.1～1.3倍。馬得草等[5]以宜賓白酒酒窖中分離的133株野生酵母為試驗菌種，采用含七葉苷培養基建立了快速篩選高產β-葡萄糖苷酶野生酵母的半定量顯色法，并篩選出2株β-葡萄糖苷酶活性較高且穩定的酵母菌株，最終鑒定為發酵畢赤酵母（Pichiafermentans）。也有報道從釀酒酵母[6]、葡萄汁有孢漢遜酵母[7]、異常畢赤酵母（Pichia anomala）[7]、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）[8]及星形假絲酵母（Candida stellata）[9]中分離到β-葡萄糖苷酶活性菌株。

本研究以內蒙古西部地區分離到的分屬6個屬7個種的340株葡萄酒相關酵母菌株為材料，對產β-葡萄糖苷酶的菌株進行初篩，進而采用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucoside，pNPG）檢測酶活性菌株產胞外、胞壁結合及胞內β-葡萄糖苷酶的能力，并對高酶活性菌株的β-葡萄糖苷酶的理化性質進行了研究，旨在為具有高產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及其在釀酒產業中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株[10]

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）、星形假絲酵母（Candida stellata）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）及克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）：分離自內蒙古西部地區。

1.1.2 化學試劑

Triton X-100、檸檬酸鹽、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）（均為分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；β-葡萄糖苷酶（酶活6 000 U/g）：美國Amersco公司；其他所用試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養基：1%酵母膏，2%蛋白胨及2%葡萄糖，pH 5.0，121 ℃，滅菌20 min。

篩選培養基：6.7 g/L酵母氮源、5 g/L熊果素（arbutin）及20 g/L瓊脂，pH 5.0，121℃，滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BCN-1360型生物潔凈工作臺：北京東聯哈爾儀器制造公司；DHP-9272型電熱恒溫培養箱、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；pHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；Millipore超純水制備系統：德國默克公司；5430臺式高速離心機：德國艾本德公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；UV-7504單光束紫外-可見分光光度計：上海新茂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴大培養

上述冷凍保藏的酵母菌株分別接種于YEPD液體培養基中，于28℃條件下靜置培養48 h。隨后，按5%（V/V）接種量將活化后的菌株接種于裝液量為20 mL/250 mLYEPD液體培養基中，于28℃、72 r/min搖床中振蕩培養24 h，用于后續實驗。

1.3.2 產β-葡萄糖苷酶菌株初篩

鑒于分離到的菌株較多，采用篩選培養基對產β-葡萄糖苷酶的菌株進行初篩，篩選方法參照RODRíGUEZME等[11]報道的方法。篩選培養基經高壓滅菌后，向其中添加2%（V/V）無菌的檸檬酸鐵銨溶液（1%水溶液），混合均勻后，制備篩選培養平板。采用劃線接種的方法將上述340個酵母菌株接種于篩選培養板上，于28℃條件下培養7 d，每天進行觀察。產β-葡萄糖苷酶的菌株周圍的培養基會形成一個深棕色暈環。

初篩菌株按5%（V/V）接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL的YEPD液體培養基中，于28℃、72 r/min搖床中振蕩培養72 h，用于后續實驗。

1.3.3 酵母細胞透化處理

酵母細胞形成的β-葡萄糖苷酶可能分泌于細胞外、與細胞壁結合或位于細胞內[6，9，11]。因此，需要對產酶菌株不同部位的酶活性進行分析。

取5 mL上述產酶酵母培養液，離心（5 000×g、10 min，4℃）沉淀酵母細胞，上清液置于冰冷環境中，用于后續的胞外β-葡萄糖苷酶活性分析。

細胞沉淀需進行透化處理，具體方法參照ROSI I等[9]報道的方法，略加改動。上述細胞沉淀經冰冷的超純水洗滌后，采用pH值為7.5的75 mmol/L咪唑緩沖液（imidazole buffer solution，IBS）1 mL重懸細胞，迅速向細胞懸液中加入透化液（50 μL 0.3 mmol/L還原型谷胱甘肽，10 μL 10%Triton X-100及50 μL甲苯∶乙醇（1∶4，V/V））混合，劇烈振蕩5min后，離心收集細胞，經冰冷的超純水洗滌2次后，細胞重懸于3 mL pH值為5.0冰冷的檸檬酸鹽緩沖液（100 mmol/L）中，用于后續的胞內β-葡萄糖苷酶活性分析。

另取5 mL酵母培養液，離心沉淀酵母細胞，經冰冷的超純水洗滌3次后，采用3 mLpH值為5.0冰冷的檸檬酸鹽緩沖液（100 mmol/L）重懸細胞，用于后續的胞壁結合的β-葡萄糖苷酶活性分析。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶活性測定

采用前人報道[6，9，11]β-葡萄糖苷酶分解對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）形成對硝基苯酚（pNP）的方法檢測β-葡萄糖苷酶活性。

取1 mL酵母細胞懸液（透化或未透化處理）或酵母細胞培養上清液加入1 mL pNPG溶液（5 mmol/L pNPG溶于100 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH5.0））中，于28℃條件下培養1 h后，向反應液中加入6 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應。采用分光光度計測定波長400 nm處吸光度值（OD400nm值）。制備pNP濃度（1～100 nmol/mL）與OD400nm值標準曲線，確定酵母細胞內外及胞壁結合的β-葡萄糖苷酶活性。

β-葡萄糖苷酶活定義：1 mg酵母干細胞（或1 mL酵母細胞培養上清液）1h水解pNPG形成1nmolpNP所需的β-葡萄糖苷酶量為1個酶活單位（nkat）。

1.3.5 酵母細胞接種量[9，11]

取50 mL酵母細胞懸液，經預先稱質量的0.45 μm濾膜過濾，酵母細胞經超純水洗滌2次后，置于105℃烘箱中過夜，待其徹底干燥后稱質量，確定1 mL酵母細胞培養液中含有的酵母細胞干質量。

1.3.6 培養條件對β-葡萄糖苷酶活性的影響

從產β-葡萄糖苷酶的不同酵母菌種中各選1株，對其胞壁結合及胞內β-葡萄糖苷酶的理化性質進行進一步研究。細胞透化處理、酶活性測定及酵母細胞接種量的確定采用上述相同的方法。

調整YEPD液體培養基中的葡萄糖添加量分別為2%、4%、6%、8%及10%，pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0及7.0，無水乙醇添加量分別為0、5%、10%及15%，溫度分別為20℃、30℃、40℃及50℃條件下培養產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株，于28℃、72r/min搖床中振蕩培養72h后，測定不同菌株細胞壁結合及胞內β-葡萄糖苷酶的活性，確定葡萄糖添加量、pH值、無水乙醇添加量及溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響。

2 結果與分析

2.1 產β-葡萄糖苷酶菌株初篩

采用含熊果素的瓊脂培養基對340株酵母菌株進行初篩，結果見表1。

表1 產β-葡萄糖苷酶酵母菌株初篩結果Table 1 Preliminary screening results of β-glucosidase producing yeast strains

由表1可知，340株初篩酵母菌株中，分屬5個屬5個種的66株酵母表現出β-葡萄糖苷酶活性，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）及星形假絲酵母（Candida stellata）。其中，異常畢赤酵母、星形假絲酵母及葡萄汁有孢漢遜酵母β-葡萄糖苷酶活性菌株檢出率較高，分別為100%、33.3%及26.8%；釀酒酵母及淺黃隱球酵母中檢出率較低，分別為16.7%及3.0%；而19株東方伊薩酵母及49株克魯維畢赤酵母無一菌株具有β-葡萄糖苷酶活性。此外，β-葡萄糖苷酶活性菌株的分布似乎僅與酵母菌種有關，而與其來源關系不大，不同葡萄品種來源的葡萄汁有孢漢遜酵母中，β-葡萄糖苷酶活性菌株檢出率差異不大，而來源于不同葡萄品種的克魯維畢赤酵母均無β-葡萄糖苷酶活性菌株檢出。

2.2 產酶菌株不同部位酶活性分析

對上述初篩出的產β-葡萄糖苷酶酵母菌株進一步確定不同部位酶的活性。采用酵母細胞培養上清液、未透化的酵母細胞及透化的酵母細胞分解pNPG形成pNP的能力確定不同部位酶的活性。初篩出的66株酵母菌株中僅1株葡萄汁有孢漢遜酵母檢測到（5.5±0.7）nkat的胞外β-葡萄糖苷酶活性，其余菌株在本實驗條件下均未檢測到細胞外β-葡萄糖苷酶活性。由于同一菌種不同菌株產β-葡萄糖苷酶的能力差異較大，因此，采用盒須圖（Box-and-Whisker）顯示不同菌種的酶活性，結果如圖1所示。

圖1 產酶菌株不同部位β-葡糖苷酶活性Fig.1 β-glucosidase activity in different parts of enzyme producing yeast strains

由圖1可知，初篩出的分屬于5個屬5個種的66株酵母菌株胞內酶活性均大于其胞壁結合酶活性，其中，胞壁結合酶活性中位數分別為釀酒酵母4.0 nkat，葡萄汁有孢漢遜酵母20 nkat，淺黃隱球酵母3 nkat，異常畢赤酵母27 nkat，星形假絲酵母5 nkat，胞內酶活性中位數分別為釀酒酵母67nkat，葡萄汁有孢漢遜酵母87nkat，淺黃隱球酵母16nkat，異常畢赤酵母202 nkat，星形假絲酵母20 nkat。其中，2株異常畢赤酵母的胞壁結合酶及胞內酶活性均為最高；其次為葡萄汁有孢漢遜酵母；而釀酒酵母、淺黃隱球酵母及星型假絲酵母的酶活性相對較低。

采用透化的酵母細胞檢測胞內β-葡萄糖苷酶的活性被前人廣泛采用[6，9，11]，其優點在于：可以將胞內與胞壁結合的β-葡萄糖苷酶分開；且酶處于酵母細胞內，仍與一些生物分子相結合或發生相互作用，能夠更為真實地反映胞內β-葡萄糖苷酶的活性；易于檢測少量酵母細胞內的β-葡萄糖苷酶活性。本實驗中β-葡萄糖苷酶的活性僅與酵母菌種有關，而與其來源無關，如異常畢赤酵母及葡萄汁有孢漢遜酵母中，胞壁結合酶及胞內酶的活性都相對較高。

2.3 不同因素對β-葡萄糖苷酶活性的影響

對上述66株具有β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌，從葡萄汁有孢漢遜酵母及異常畢赤酵母中各選擇1株β-葡萄糖苷酶活性最高菌株（葡萄汁有孢漢遜酵母為菌株C12，異常畢赤酵母為菌株C56），連同其他3個種的3株β-葡萄糖苷酶活性菌株（釀酒酵母為菌株C54，淺黃隱球酵母為菌株CF68，星形假絲酵母菌株為C59）一起進行β-葡萄糖苷酶活性檢測，以最大酶活作為100%，計算相對酶活，結果見圖2。

由圖2A可知，隨著葡萄糖添加量的增加，β-葡萄糖苷酶活性呈逐漸下降的趨勢，這一下降趨勢與菌種及酶所處的位置（胞壁結合酶及胞內酶）無關。當培養液中葡萄糖添加量達到4%時，所有檢測菌株的β-葡萄糖苷酶活性下降約50%；當葡萄糖添加量達到10%時，所有檢測菌株中的β-葡萄糖苷酶活性均下降至其最高活性的20%～40%。結果表明，葡萄糖添加量＞4%對β-葡萄糖苷酶的活性不利。

由圖2B可知，胞壁結合酶在pH值為5.0培養液中酶活性最高，在pH3.0～5.0或pH5.0～7.0培養液中，酶活性均有所下降，但下降趨勢并不劇烈；而當pH值為3.0或7.0時，酶活性發生急劇下降，pH 7.0時的酶活性僅為最高酶活性的10%～20%。胞內酶的最佳pH環境與胞壁結合酶略有不同，其最佳pH值為6.0，當培養液pH值為5.0時，酶活性略有下降，當培養液pH值為3.0或7.0時，酶活性急劇下降，pH 3.0中的酶活性僅為最佳酶活性的30%～50%。結果表明，β-葡萄糖苷酶的最大酶活性pH在5.0～6.0之間，胞壁結合酶與胞內酶可能由于所處的結合狀態不同，最佳pH環境略有不同。

由圖2C可知，在乙醇體積分數為0～15%的范圍內，不同菌株、不同部位的β-葡萄糖苷酶活性變化不大，隨著乙醇體積分數的升高，酶活性略有下降，當乙醇體積分數為15%時，酶活性仍為其最高活性的80%～100%。結果表明，β-葡萄糖苷酶對低體積分數乙醇的敏感性不強。

圖2 不同因素對β-葡糖苷酶活性的影響Fig.2 Effects of different factors on β-glucosidase activity

由圖2D可知，不同菌株中、處于不同部位的β-葡萄糖苷酶在環境溫度為40℃時均具有最佳的酶活性，隨著環境溫度升高或降低，酶活性均急劇下降，當環境溫度為20℃時，酶活性僅為最高酶活性的30%～50%。結果表明，β-葡萄糖苷酶對環境溫度的變化較為敏感，其最適溫度為40℃。

上述結果與前人報道的結果相似。ROSI I等[9]對篩選出的分屬12個屬14個種的14株葡萄酒相關酵母菌株進行β-葡萄糖苷酶活性檢測，僅2株菌株檢測到胞外酶活性。DELCROIX A等[12-15]雖然也檢測到釀酒酵母胞外β-葡萄糖苷酶活性，但其酶活性遠遠低于胞壁結合及胞內β-葡萄糖苷酶活性。這些結果表明，活性菌株分解熊果素的能力主要依賴于其胞壁結合的β-葡萄糖苷酶。

3 結論

本研究從內蒙古西部地區4種葡萄漿果表面分離到的分屬6個屬7個種的340株酵母菌株中初篩獲得66株β-葡萄糖苷酶活性菌株，這些活性菌株分屬5個屬5個種，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）及星形假絲酵母（Candida stellata）。

檢測的所有酶活性菌株中，除1株葡萄汁有孢漢遜酵母檢測到較低的胞外β-葡萄糖苷酶活性外，其他菌株均無法檢測到胞外酶活性。此外，所有檢測的酶活性菌株中，胞內酶的活性均大于其胞壁結合酶的活性。從不同菌種中分離到的酶活性菌株比例與酶活性高低來看，酶活性相對較高的菌種中分離到活性菌株的比例也相對較高。

不同菌種來源的β-葡萄糖苷酶的理化性質相同，包括對葡萄糖、乙醇的耐受力，最適pH值及最適溫度，僅胞壁結合酶與胞內酶的最適pH值略有差異。

結果表明，釀酒酵母與異常畢赤酵母混合接種發酵有利于利用后者的β-葡萄糖苷酶降解葡萄汁中的糖苷類物質，從而釋放芳香類物質，增加葡萄酒的香氣。然而，由于該酶的活性隨糖添加量的升高而急劇下降，考慮到隨著葡萄汁發酵過程的進行，葡萄汁中的糖含量逐漸降低，pH值變化不大，酒精濃度逐漸升高，而添加4%以上葡萄糖會抑制該酶的活性，因此可在發酵中后期接種異常畢赤酵母。異常畢赤酵母胞內酶活性高于胞壁結合酶活性，因此接種經透化處理后的該菌種有利于利用其胞內β-葡萄糖苷酶。此外該酶在20～40℃范圍內時，酶活性隨溫度的升高而逐漸上升，因此適當提高發酵溫度有利于該酶的活性，但發酵溫度過高會影響到釀酒酵母的生長。本研究結果可為采用野生酵母菌種混合發酵釀制具有地區特色的葡萄酒提供理論及技術基礎，相關研究有待進一步進行。