活性干酵母活化時間與級數對葡萄酒發酵的影響

劉嘉璐，孫玉梅*，黃 超，唐文竹

（大連工業大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

在葡萄酒的釀造過程中，釀酒酵母主導著整個生物轉化過程。葡萄汁中的糖分通過釀酒酵母的代謝作用，轉化成酒精、有機酸以及各種風味物質[1]。

在工業生產中，為了避免擴大培養酵母，通常采用活性干酵母。由于活性干酵母細胞內含水量低（＜6%）[2]，需要活化后使用[3]。選擇合適的釀酒酵母酵母活化條件，可以有效提高釀酒酵母的活性[4-5]。干酵母于36～40℃無菌水中活化15 min，即可接種到發酵罐中[6]。也可以將活性干酵母在20倍（質量比）含糖5%的溫水（35～40℃）中分散均勻，活化20～30 min[7]。王傳榮[8]研究的安琪耐高溫酒精活性干酵母（temperature tolerant Angel active dry yeast，TH-AADY）復水溫度為35～40℃，時間為10～15 min，活化溫度為35℃，活化時間為60 min。SCHMIDT S A等[9]把活性干酵母在35～43℃復水活化15 min，即可以使細胞的活力恢復到最佳的狀態。KONTKANE D等[10]將活性干酵母進行3 h 15 min的糖度（10°Bx、20°Bx）和溫度（40℃、25℃、20℃）梯度馴化，接種發酵后的酵母生物量、耗糖、產酒精明顯高于不馴化直接接種方式。酵母的不同活化方式可以有效避免由于酵母的大量失活而導致起酵緩慢、發酵停滯等問題。為了加快葡萄汁酒精發酵的啟動，或者葡萄汁存在發酵不徹底的危險，可以在24 h前制備母液[7]。對于不同的酵母種類、發酵溫度，通用的活化方式不一定可以有效提高酵母活性，而同一活化時間不同的活化級數也可能對酵母活性與葡萄酒發酵有影響。

本研究通過檢測發酵過程中酵母的活細胞濃度和總菌體濃度、二氧化碳生成量和耗糖量以及乙醇和乙酸產量，探究用于葡萄酒釀造的活性干酵母LV的活化時間和活化級數對葡萄酒發酵的影響，以期活性干酵母在葡萄酒發酵過程中有較好的生長和代謝狀態，控制其活化條件對其活性的提高和葡萄酒發酵有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性干酵母LV：遼寧本溪桓仁五女山米蘭酒業有限公司；24°Bx普通葡萄模擬汁：根據葡萄的成分組成[11]以及參考文獻[12-15]配制。

葡萄糖、果糖：山東西王藥業有限公司；酵母浸粉：北京奧博星生物試劑有限公司；多種氨基酸（色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸）：上海阿拉丁生化科技有限公司。乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙酸（分析純）：天津市恒興化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型精密pH計、722S型分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；HITACHI CR21 GⅢ離心機：日本日立工機株式會社；ZHJH-C2109B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；GC8900氣相色譜儀：山東經緯分析儀器有限公司；FFAP色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）：大連三杰科技發展有限公司；N2000色譜工作站：浙江大學智達信息工程有限公司；SPME 57330-U萃取手柄、SPME 65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭：美國SUPELCO有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母的活化

本研究對LV活性干酵母進行（25 min、3 h 15 min和24 h 15 min）三種活化時間，其中3 h 15 min活化分為兩級和三級并同時采用不同糖度的活化，詳見表1。活化后接種到24°Bx葡萄模擬汁中，于24℃控溫發酵。

表1 LV活性干酵母的活化方式Table 1 Activation methods of LV active dry yeast

1.3.2 葡萄酒釀造工藝流程

配制模擬葡萄汁→分裝模擬葡萄汁（500 mL/瓶）→接種酵母菌種子液→24℃控溫發酵→終止發酵

操作要點：無機鹽、維生素和氨基酸分別制成母液備用，再與其他試劑混合均勻后配制模擬葡萄汁分裝使用（為了保持實驗的一致性，因此自行配制模擬葡萄汁而不采用天然葡萄汁）。發酵體系為1 L三角瓶，每個三角瓶分別裝入500 mL普通葡萄模擬汁。活性干酵母接種量為0.25 g/L，經不同方式活化（酵母濃度為2.8×109個/mL）后接種16 mL到500 mL葡萄汁中進行24℃控溫發酵。發酵前2 d用棉塞封瓶口。當發酵液中有氣體產生時，把棉塞換為發酵栓，每個發酵栓中加滅菌水8 mL，開始厭氧發酵。在發酵液中的還原糖量降至不變時，終止發酵。發酵初期為第0～4天，發酵中期為第5～10天，發酵后期為第11～18天。

模擬葡萄汁參考普通葡萄汁的化合物含量，無機鹽、維生素與氨基酸分別制成母液備用（見表2）。每種活化分別設置2個平行。

表2 模擬普通葡萄汁的配方[11]Table 2 Formula of normal synthetic grape juice

1.3.3 樣品的取樣及處理

發酵過程中，活酵母菌濃度與總菌體濃度在第0、1、2、4、7、11、14、18天取樣（3 mL）測定；CO2生成量每天測定；還原糖含量在第1、2、4、7、11、18天取樣（1 mL）測定；乙醇和乙酸含量在第0、2、4、7、13、18天取樣（21 mL）測定，樣品保存于-20℃冰箱中。

測定各理化指標前，于4℃冰箱中解凍。其中還原糖、乙醇和乙酸的樣品需要離心（10 000 r/min、4℃、10 min）得發酵上清液。

1.3.4 活酵母菌濃度測定

發酵液樣品用呂氏堿性美藍染色，在顯微鏡下計活酵母菌數（活酵母不被染色，死亡的酵母被染成藍色）[16]。

1.3.5 菌體密度的檢測

適量稀釋樣品后，分光光度計在波長600 nm處檢測吸光度值OD600nm。

1.3.6 還原糖含量測定

采用 3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法測定還原糖含量[17]。

1.3.7 CO2生成量測定

發酵開始后，每天固定時間稱取發酵瓶的質量。從培養箱取出的發酵瓶放入搖床，于100 r/min搖動5 min。待氣泡消失后，用電子天平測量發酵瓶質量。通過前后兩次稱質量的差值來反映CO2生成量。如需取出發酵液樣品，需要測量取樣前后發酵瓶的質量[18]。

1.3.8 乙醇和乙酸的測定

采用頂空-固相微萃取-氣相色譜法（headspace solid phase microextraction-gas chromatography，HS-SPME-GC）檢測樣品中乙醇和乙酸的含量。

固相微萃取條件：向20 mL頂空瓶中加入7 mL樣品，1.4 g NaCl和磁力攪拌轉子，加蓋密封。49℃水浴加熱，攪拌速率250 r/min，平衡時間10 min，然后插入萃取纖維頭（65 μm PDMS/DVB、SUPELCO），萃取時間為45 min。萃取完成后，將纖維頭插入氣相色譜汽化室，解吸5 min。

氣相色譜條件：FFAP毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.5 μm）；汽化室溫度250℃，火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID）溫度 250℃，色譜柱初始溫度40℃，保持3 min，以1.5℃/min速率升溫至46℃，保持2 min，以6℃/min速率升溫至52℃，保持3 min，以5℃/min速率升溫至190℃，保持2 min；空氣流量300 mL/min，氫氣流量30mL/min，載氣為氮氣（N2），流量 30mL/min，分流比10∶1。

2 結果與分析

2.1 活化時間對葡萄酒發酵的影響

2.1.1 活化時間對發酵過程中活酵母菌濃度與總菌體濃度的影響

不同的活化時間對發酵過程中LV干酵母活菌濃度及總菌體濃度的影響結果見圖1。由圖1可知，雖然3種活化時間的酵母在發酵過程中總菌體濃度沒有較大差異（P＞0.05），但是活酵母菌濃度差異較大（P＜0.05）。在發酵初期，各種活化實驗組的活酵母菌數量呈上升趨勢。活化3h 15min的活酵母菌濃度高于另外兩組（P＜0.05），在發酵中期仍處于增長狀態，最高達到4.23×107個/mL；活化24 h 15 min的活酵母菌濃度略低；活化25 min的酵母在發酵中期活酵母菌濃度最早（第10天）開始下降。

圖1 不同活化時間的LV干酵母在發酵過程中活酵母菌濃度(A)及菌體總濃度(B)的變化Fig.1 Changes of viable yeast concentration(A)and total yeast concentration(B)during fermentation by LV dry yeast with different activation time

由此可見，活化3 h 15 min可以使酵母在發酵初期快速生長繁殖，擁有較高的活性。說明較長時間的活化，有利于酵母充分地適應發酵環境，并維持生長活力，表現為較長時間和較大量的細胞生長。而過長時間的活化可能會使酵母在種子液中因營養耗盡而活力下降，短時間活化不利于酵母在發酵過程中維持較長時間的生長活性。

2.1.2 活化時間對發酵過程中還原糖含量的影響

不同的活化時間對發酵過程中還原糖含量的影響結果見圖2。由圖2可知，在發酵初期，即發酵第2天檢測的活化3h15min和24h15 min的酵母還原糖含量分別為98.95 g/L和111.26 g/L，結果表明，活化3 h 15 min的酵母發酵消耗的還原糖較多，活化24h15min的酵母其次。這與不同時間活化的酵母在發酵初期的活酵母菌濃度及總菌體濃度的差異一致。在發酵第7天檢測還原糖含量根據發酵時間由短到長分別為66.06 g/L、40.93 g/L、53.17 g/L，表明活化25 min的酵母耗糖最慢。

圖2 不同活化時間的LV干酵母在發酵過程中還原糖含量的變化Fig.2 Changes of reducing sugar contents during fermentation by LV dry yeast with different activation time

由此可見，較長時間活化可以使酵母快速適應環境，較快和較多地生長繁殖，并維持較高的發酵活力。而過長或過短時間的活化會使酵母生長和發酵活力較低。

2.1.3 活化時間對發酵過程中CO2生成量的影響

不同的活化時間對發酵過程中CO2生成量的影響結果見圖3。由圖3可知，隨發酵時間的延長，CO2生成量逐漸增加，發酵初期升高較快，發酵中期和后期升高較慢，到12 d后CO2的生成量基本不變，活化時間由短到長CO2的生成量依次為90.29 g/L、77.27 g/L和86.42 g/L。發酵中期和后期的各組CO2生成量差異明顯（P＜0.05），活化25 min的酵母發酵CO2生成量最多，為91.2 g/L；活化3 h 15 min的酵母CO2生成量最少，為78.35 g/L。

圖3 不同活化時間的LV干酵母在發酵過程中的CO2生成量變化Fig.3 Changes of CO2production during fermentation by LV dry yeast with different activation time

CO2的生成量差異可以體現出發酵過程中的酵母活性的差異[17]，活化3 h 15 min的酵母CO2生成量較低，可能是因為細胞生長能力較強，所以發酵性能較高。而活化過長或過短時間的酵母CO2的生成量較高，圖1也顯示了相應活化時間的酵母生長量較少，可能在葡萄酒發酵中較多的CO2抑制了釀酒酵母的生長[19]，并降低了細胞活性，比如活化25 min的酵母在發酵中期活酵母菌濃度最早（第10天）開始下降。結果表明，CO2生成量的差異與活化不同時間的酵母在發酵過程中還原糖含量的差異一致。

2.1.4 活化時間對發酵過程中乙醇和乙酸含量的影響

不同活化對發酵過程中乙醇和乙酸含量的影響結果見圖4。由圖4A可知，活化3 h 15 min的酵母在整個發酵過程中乙醇產量均高于另外兩種活化時間的酵母。在發酵初期，活化24 h 15 min與活化25 min的酵母乙醇產量無明顯差異（P＞0.05）；在發酵中期和后期，即在發酵第10天和第18天的檢測結果表明，活化24h15min的酵母乙醇產量分別為38.54g/L和56.59 g/L，均高于活化25 min的酵母乙醇產量，為32.66 g/L和46.5 g/L。在發酵第15～18天實驗組乙醇的積累基本達到穩定。發酵終止時，活化3 h 15 min的釀酒酵母乙醇積累量較多（60.4 g/L），明顯高于25 min活化的方式，略高于24 h 15 min活化方式（56.59 g/L）。由此可見，較長時間活化可以提高酵母乙醇發酵活性。由圖4B可知，在發酵過程中，3種活化時間的酵母在發酵過程中的乙酸產生量逐漸增多，發酵14 d后的乙酸生成速率減小，隨酵母活化時間的延長最終乙酸產量依次增加（P＜0.05）。乙酸是酒精發酵的副產物，一般控制普通葡萄酒中乙酸含量低于1.2 g/L[20]。3種活化時間的酵母，乙酸的產量都能滿足葡萄酒發酵控制乙酸生成量的要求，為保證葡萄酒質量，不宜過長時間活化酵母。

圖4 不同活化時間的LV干酵母在發酵過程中乙醇(A)和乙酸(B)含量的變化Fig.4 Changes of ethanol(A)and acetic acid(B)contents during fermentation by LV dry yeast with different activation time

2.2 活化級數對葡萄酒發酵的影響

2.2.1 活化級數對發酵過程中活酵母菌濃度與總菌體濃度的影響

不同的活化級數對發酵過程中LV干酵母活菌濃度及總菌體濃度的影響結果見圖5。由圖5A可知，三級活化的酵母在發酵初期的酵母活菌濃度高于二級活化的酵母，達到4.51×107個/mL。在發酵第11天，二級活化的酵母活菌濃度達到最大值，為4.43×107個/mL。由圖5B可知，在發酵前2 d，菌體總濃度的差異不明顯（P＞0.05）。在發酵中期和后期，三級活化的酵母菌體總濃度基本高于二級活化（P＜0.05）。在發酵后期，三級活化的酵母活菌濃度基本高于二級活化（P＜0.05）。

圖5 不同活化級數的LV干酵母在發酵過程中活酵母菌濃度(A)及總菌濃度(B)的變化Fig.5 Changes of viable yeast concentration(A)and total yeast concentration(B)during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

由此可見，三級活化的酵母在發酵過程中的活酵母菌濃度基本高于二級，總菌體濃度在發酵中期和后期均處于較高的狀態。因此，不同的活化級數對于在發酵過程中活酵母菌濃度和總菌濃度具有顯著影響（P＜0.05）。

2.2.2 活化級數對發酵過程中還原糖含量的影響

不同的活化級數對發酵過程中還原糖含量的影響結果見圖6。由圖6可知，在發酵初期，兩種級數活化的酵母發酵消耗還原糖差異不明顯（P＞0.05），發酵第2天檢測二級與三級活化的酵母還原糖含量分別為214.1 g/L和218.24 g/L。到了發酵中期，消耗的還原糖含量差異顯著（P＜0.05），第7天檢測三級活化的酵母還原糖含量為31.96 g/L，二級活化的酵母還原糖含量為40.93 g/L，可知三級活化的酵母消耗還原糖的能力高于二級。最終，在14～18 d還原糖含量逐漸降為0。由此可見，不同級數活化的酵母在發酵中期消耗還原糖的含量差異顯著（P＜0.05）。

圖6 不同活化級數的LV干酵母在發酵過程中還原糖含量的變化Fig.6 Changes of reducing sugar contents during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

2.2.3 活化級數對發酵過程中CO2生成量的影響

不同的活化級數對發酵過程中CO2生成量的影響結果見圖7。由圖7可知，不同活化級數的酵母在發酵過程中CO2生成量無明顯差異。由此可見，活化級數對酵母發酵過程中CO2生成量無顯著影響（P＞0.05）。

圖7 不同活化級數的LV干酵母在發酵過程中的CO2生成量變化Fig.7 Changes of CO2production during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

2.2.4 活化級數對發酵過程中乙醇和乙酸含量的影響

由圖8A可知，在發酵初期和中期，即發酵第4天和第10天檢測乙醇，三級活化的酵母乙醇的產量（30.47 g/L和48.65g/L）均顯著高于二級（26.69g/L和46.33g/L）（P＜0.05）。而至發酵后期，二者乙醇的積累量相差不大（P＞0.05）。由此可見，兩種不同級數活化的酵母在發酵初期和中期對乙醇的產量的影響較為顯著（P＜0.05），但最終乙醇的積累無顯著差異（P＞0.05）。

由圖8B可知，兩種活化級數的酵母在發酵前期乙酸產量有顯著差異（P＜0.05），在發酵第4天檢測乙酸含量，三級活化的酵母乙酸產量高于二級，分別為0.35 g/L和0.32 g/L。但在發酵中期和后期無顯著差異（P＞0.05）。最終乙酸的產量均＜1.2 g/L。

圖8 不同活化級數的LV干酵母在發酵過程中乙醇(A)和乙酸(B)含量的變化Fig.8 Changes of ethanol(A)and acetic acid(B)contents during fermentation by LV dry yeast with different activation stages

3 結論

通過不同的活化時間和級數活化活性干酵母LV，接種到模擬葡萄汁進行葡萄酒發酵。結果表明活化時間和級數對釀酒酵母生長及發酵能力有較大影響。活化3h15min比活化24 h 15 min和25 min的酵母生長代謝能力強，酵母活菌濃度達到4.23×107個/mL；耗糖快；產乙醇較多，在發酵18 d后達到60.4 g/L。進行三級3 h 15 min活化活酵母菌濃度較大，最高達到4.51×107個/mL；兩種級數活化的酵母在發酵過程中還原糖含量差異顯著（P＜0.05），CO2生成量、乙醇和乙酸沒有顯著差異（P＞0.05）。如果在工業生產中對酵母的含量活性要求較高，建議采用3 h 15 min三級活化的方式。