蛋白組學差異揭示黑曲霉（Aspergillus niger）高產檸檬酸的分子機制

謝 慧，王風清，魏東芝*

（1.華東理工大學 生物反應器國家重點實驗室，上海 200237；2.河南農業大學 生命科學學院，河南 鄭州 450002）

我國是檸檬酸生產大國，占全球市場份額的70%以上，在產量和產品質量上均具有很強的競爭力。中國檸檬酸工業的強大競爭力主要得益于生產菌種具有利用廉價淀粉類物質高產檸檬酸的強大能力[1-2]。菌株（Aspergillus niger）YX-1217是一株典型的檸檬酸高產菌株，能利用玉米粉水解液，在38～39℃發酵55h產生180.0～200.0g/L檸檬酸。然而A.nigerYX-1217在遺傳上不穩定，易于自然衰退，為了保持菌株高檸檬酸產量的特性，必須定期進行菌種活化，否則會衰退為低產檸檬酸菌株（命名為A.nigerYX-1217G），產酸量只有高產菌株的70%，為企業帶來巨大經濟損失[3]。

常見的蛋白質組學研究方法包括二維聚丙烯酰胺凝膠電泳（two-dimensionalpolyacrylamide gelelectrophoresis，2-DE）、質譜技術（mass spectrometer，MS）、肽序列標簽、蛋白質微陣列、核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術以及其他研究蛋白質相互作用的方法如酵母雙雜交系統等[4-8]。近年來，由美國應用生物系統公司（appliedbiosystems，ABI）研發的同位素標記相對和絕對定量（isobaric tagsforrelativeandabsolutequantification，iTRAQ）技術為解決低豐度蛋白質的定性及定量研究提供了有效的技術支持[9-10]。KIM Y等[11]總結了應用于曲霉蛋白質組學研究中的各種方法和技術，結果共鑒定了28個細胞表面蛋白，102個與分泌相關的蛋白以及139個胞內蛋白，同時也構建了代謝途徑中關鍵基因的蛋白質組圖譜。蛋白質組學技術不僅可以用于真菌致病機理的研究，也可用于絲狀真菌的代謝網絡調節研究。LU X等[12]分別以麥芽糖和木糖為碳源，對在誘導和非誘導條件下A.niger的蛋白質組進行比較，研究表明，在誘導和非誘導條件下胞漿蛋白質組并沒有明顯的差異，主要差異體現在胞外分泌蛋白，特別是植物細胞壁降解蛋白。蛋白質組學技術的發展，為工業菌種改造奠定基礎，為改進工業發酵過程提供新的途徑[13]。

本研究基于2D-PAGE和iTRAQ這兩種蛋白質組學技術，將菌株A.nigerYX-1217和菌株YX-1217G的胞外分泌蛋白和胞內蛋白進行比較，重點分析和檸檬酸產生相關基因的表達差異，揭示菌株A.nigerYX-1217生產檸檬酸的高產機制，并為開發檸檬酸或其他有機酸的高產菌株提供新的思路和觀點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

菌株A.nigerYX-1217和A.nigerYX-1217G：濰坊英軒實業有限公司。

1.1.2 化學試劑

尿素、硫脲、Pharmalyte 3-10、TritonX-100、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）、丙磺酸、三羥甲基氨基甲烷（trismetyl aminomethane，Tris）、溴酚藍：美國Sigma公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺：美國伯樂公司；固相pH梯度（immobilized pH gradient，IPG）膠條（pH 3～10，24 cm）：美國GE公司。實驗所用化學試劑均為分析純。

1.1.3 培養基[3]

玉米粉種子培養基：將250 g玉米粉加入1 L水中，攪拌均勻后不斷添加耐高溫α-淀粉酶（40000U/mL），在105℃條件下進行液化直到碘指示劑測試結果不顯示藍色，此時糖度大約為16～18°Bx，獲得玉米粉糖化液即可用作種子培養基。

玉米粉發酵培養基：將玉米粉糖化液經兩層紗布過濾，將過濾的和未過濾的玉米粉糖化液以體積比6∶1混合，混合液即為玉米淀粉發酵培養基，測定總糖質量濃度為178.1 g/L。

1.2 儀器與設備

24孔Minibeadbeater：美國Biospec公司；IP Gphor等電聚焦電泳系統、Ettan DALT Six SDS-PAGE垂直電泳系統：美國GE Healthcare公司；5415D臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；4800Plus基質輔助激光解吸電離-飛行時間-質譜（matrix-assistedlaserdesorption/ionization-timeofflightmass spectrometry，MALDI-TOF-MS）：美國AB Sciex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 2D-PAGE實驗方案

2D-PAGE的實驗方案在參考文獻[6-8]的基礎上做了修改，等電聚焦運行參數為水化：50 V 10 h；梯度等電聚焦：100V1h、200V1h、500V1h、1000V1h；升壓程序：10000V 1 h、10 000 V 100 000 V·h、500 V 10 h。

1.3.2 iTRAQ實驗方案

iTRAQ實驗方案見參考文獻[9-10]。

1.3.3 數據分析

本實驗分析的樣本為黑曲霉（A.niger），UniProt數據庫中關于A.niger蛋白質的記錄只有9個，而美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）匹配到的條目較多，一般來說，數據庫越大，能夠匹配和鑒定到的蛋白質就越多。因此，本次使用數據庫為A.nigerNCBInr+Uniport合庫（28 953條序列）。

2 結果與分析

2.1 菌株A.nigerYX-1217和YX-1217G生長特性與檸檬酸產量比較

菌株A.nigerYX-1217和YX-1217G在玉米粉發酵液中35℃培養60 h，發酵結果如表1所示。

表1 兩株菌在35℃發酵60 h的生物量、殘糖以及檸檬酸含量比較Table 1 Comparison of biomass,residual sugar,citric acid concentration of the two strains at 35℃for 60 hg/L

菌株A.nigerYX-1217是一株典型檸檬酸高產工業菌株，發酵60 h時檸檬酸產率可高達3.0 g/（L·h），此時產量為180.0 g/L，而殘糖量只有3.5 g/L。與之相比，退化菌株YX-1217G在發酵60 h時檸檬酸產率只有1.1 g/（L·h），檸檬酸產量為65.0 g/L，而發酵液殘糖量為43.8 g/L，其檸檬酸生產能力與菌株YX-1217相比下降了64%。總之，菌株YX-1217的檸檬酸產量比菌株YX-1217G多115 g/L，同時細胞干質量比其少15 g/L。菌株YX-1217G檸檬酸產量低的原因不僅由于發酵末期發酵液中還原糖沒有被徹底消耗，且消耗的還原糖很大程度上來用于增加菌體的生物量。兩株來源相同的菌，由于菌株退化而導致檸檬酸產量有較大差異，因此這兩株菌是利用蛋白組學分析A.niger檸檬酸高產機制的好樣本。

2.2 基于2-DE分析A.nigerYX-1217和A.nigerYX-1217G胞外分泌蛋白差異

基于二維電泳技術分析不同樣本之間（菌株A.niger YX-1217和菌株A.nigerYX-1217G）胞外分泌蛋白差異，通過SWISS-PROT數據庫分析，獲得6個差異明顯的蛋白，各點在2-DE圖中的位置如圖1所示。

圖1 基于2-DE的菌株YX-1217和菌株YX-1217G胞外分泌蛋白比較Fig.1 Comparison of extracellular protein between strain YX-1217 and strain YX-1217G based on 2-DE

從膠上摳取差異蛋白點，用基質輔助激光解析飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）進行分析，各差異蛋白的具體信息見表2。

表2 菌株YX-1217和菌株YX-1217G樣本間差異蛋白分析Table 2 Analysis of differential proteins between strain YX-1217 and strain YX-1217G

由表2可知，6個差異蛋白都為水解蛋白酶，且都具有豐度＞5-fold的明顯差異（P＜0.05）。

（1）spot 1（酸性α-淀粉酶）：玉米粉液化pH為5.8～6.2，而A.niger利用淀粉液化液發酵生產檸檬酸時，其pH迅速從6.0左右降至2.5。菌株A.nigerYX-1217可分泌大量的酸性α-淀粉酶，和菌株A.nigerYX-1217G相比，其差異倍數（Fold-change）為15.6。耐酸性α-淀粉酶在低pH值的條件下，隨機切斷淀粉分子內的α-1,4糖苷鍵，生成低聚糖、麥芽糖和糊精等，使淀粉黏度下降[14]。所以菌株A.nigerYX-1217更能充分利用玉米淀粉液化液，并在培養基中生長良好。

（2）spot 2,3（葡糖糖化酶）：該酶能水解液態淀粉中的α-1,4-糖苷鍵和α-1,6糖苷鍵。水解過程中，從底物分子中的非還原端開始，逐步水解出葡萄糖。當菌株A.nigerYX-1217生產檸檬酸時，其玉米淀粉的預處理過程只需要加入α-淀粉酶進行液化，而不需要額外加入葡糖淀粉酶進行糖化，因為該菌株能分泌大量糖化酶，和菌株A.nigerYX-1217G相比，其差異倍數（Fold-change）分別為11.3和10.5。因此不僅原料利用更充分，且節約成本。

（3）spot 4（精氨酸蛋白酶）：肽鏈內切酶，能水解蛋白質類底物，參與機體的新陳代謝及生物調控作用。它的活性中心由兩個催化性天冬氨酸殘基組成。菌株A.niger YX-1217G可分泌大量的精氨酸蛋白酶，和菌株A.niger YX-1217相比，其差異倍數（Fold-change）為15.4。

（4）spot 5（酰胺酶）和spot 6（幾丁質酶）：都為胞外水解酶類，和A.nigerYX-1217G相比，菌株A.nigerYX-1217分泌量較高，其差異倍數（fold-change）分別為7.1與5.3。能快速講解胞外物質，使原料利用更加充分。

總之，和菌株A.nigerYX-1217G相比，菌株A.niger YX-1217具有更強大的胞外水解酶系統，能夠將玉米粉水解液快速、徹底的水解成葡萄糖等糖類，為菌株提供充分碳源，這是該菌株檸檬酸高產的主要原因之一。

但是由于菌株A.nigerYX-1217產生酸性α-淀粉酶、葡糖糖化酶豐度較高，使得低豐度蛋白的獲取存在一定困難，獲取的蛋白點數較少，在一定程度上限制了菌株A.niger YX-1217分泌蛋白組的研究。

2.3 基于iTRAQ技術分析菌株A.nigerYX-1217和菌株A.nigerYX-1217G胞內蛋白差異

為了直接揭示這些菌株間代謝差異，每一株菌選擇兩個培養點（10 h和40 h）作為樣品進行蛋白組學分析，共計4個樣品，分別是菌株A.nigerYX-1217-10 h（S1-10），菌株A.nigerYX-1217-40 h（S1-40），菌株A.nigerYX-1217G-10 h（S3-10）菌株A.nigerYX-1217G-40 h（S3-40）。

2.3.1 蛋白質鑒定與定量

本研究使用iTRAQ技術進行蛋白質相對定量，所用的質譜儀器是Triple TOF 5600。通過Mascot軟件進行分析后，匹配到的譜圖數量是41330張，其中Unique譜圖數量為40086張，共鑒定到3 553個蛋白。當蛋白豐度差異倍數達到1.2倍以上，且經統計檢驗其P值＜0.05時，視為差異蛋白。

2.3.2 差異蛋白的途徑富集分析

為了探索不同樣本間的代謝差異，將差異蛋白按照京都基因與基因組百科全書（KyotoEncyclopediaofGenesand Genomes，KEGG）代謝數據庫進行分類，尤其是與檸檬酸生物合成相關的代謝途徑，如糖酵解途徑（embden meyerhof pathway，EMP）、磷酸己糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）、三羧酸循環（tricarboxylicacidcycle，TCA）、脂肪酸代謝（fatty acid metabolism，FAM）等。菌株A.niger YX-1217與菌株A.nigerYX-1217G在碳源代謝中的差異表達分析結果見表3。

表3 涉及碳源代謝的差異蛋白分析Table 3 Analysis of differential protein involved in carbohydrate metabolism

（1）涉及糖酵解途徑的差異蛋白分析

糖酵解途徑在整個生長過程中實現碳源的初代謝，為菌體提供能量并為菌體生長的其他代謝和檸檬酸的合成提供必需的底物。由表3可知，糖酵解相關的一些酶在菌株YX-1217中的表達量比在菌株YX-1217中明顯增加。己糖的磷酸化由己糖激酶（hexokinase，Hk）和葡萄糖激酶（glucokinase，Gk）共同作用，但是兩種酶的基因彼此孤立，動力學決定性因素也不同。Hk是酵解過程EMP途徑的第一個酶，是限速酶；而Gk是一個誘導酶，二者都能將葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G-6-P）。在菌株YX-1217中，兩個酶的表達量在10 h階段明顯增加，差異倍數分別為1.912和1.581，但是當發酵40 h時，Gk的蛋白差異不明顯。6-磷酸葡萄糖異構酶（glucose-6-phosphate isomerase，Gpi）是EMP途徑的第二個酶，能將G-6-P轉化成F-6-P，在YX-1217菌株中，該酶的表達量在發酵10 h和發酵40 h均明顯上調，差異倍數分別為1.759和1.453。磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，Pfk）在YX-1217菌株中明顯下調，表達量低于菌株YX-1217G。該酶受到檸檬酸的抑制，這種抑制可以被NH4+和高濃度無機磷酸鹽解除。研究表明，在菌株A.niger中檸檬酸的積累伴隨胞內NH4+濃度的增加，從而解除了檸檬酸對Pfk的抑制[15-16]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenas，Gpd）是糖酵解途徑、檸檬酸循環以外的另一個葡萄糖分解途徑-磷酸戊糖途徑中的第一個酶，它催化6-磷酸葡萄糖脫氫形成6-磷酸葡糖酸。以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）為電子受體，整個反應的平衡是趨向于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的生成。該酶在菌株YX-1217中表達量明顯上調，與菌株YX-1217G相比，差異倍數為1.647和1.445。

（2）涉及檸檬酸循環的差異蛋白分析

丙酮酸羧化酶（pyruvatecarboxylase，Pc）存在于線粒體中，是催化如下不可逆反應的關鍵性酶：丙酮酸+CO2+三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）+H2O→草酰乙酸+二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）+磷酸。在TCA循環中，它是供給草酰乙酸的主要補充反應，而草酰乙酸是生成檸檬酸的重要前體之一。由表3可知，在菌株YX-1217中，Pc的表達量明顯增加，與菌株YX-1217G相比，差異倍數分別為2.303和2.001。檸檬酸是TCA循環中一種重要的中間體，而檸檬酸合成酶（citrate synthase，Cs），作為第一步反應的限速酶，可以催化草酰乙酸和乙酰輔酶A（coenzyme A，CoA）縮合形成檸檬酸，是檸檬酸生產中最重要的酶[17-18]。本研究鑒定出3種檸檬酸合酶Cs，這3種酶在菌株YX-1217中表達量普遍明顯增加，差異倍數分別為1.617、2.013和2.532。作為檸檬酸生產過程中最關鍵的酶，該酶在菌株YX-1217中的高效表達可能是該菌檸檬酸高產的原因之一。然而在菌株YX-1217中，烏頭酸水合酶（aconitate hydratase，Aco）和異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，Idh）表達量在種子10 h明顯增加，使生成的檸檬酸繼續參與代謝而被降解，從而不利于檸檬酸的積累，但同時帶動TCA循環繼續進行，使檸檬酸以后的步驟有被激活的跡象，產生更多的ATP來滿足代謝需求。但是當發酵到40 h時，蛋白差異不明顯。有報道稱，在檸檬酸發酵初期，NAD-和NADP-專一性異檸檬酸脫氫酶具有很高的活性，將檸檬酸通過TCA循環轉化為酮戊二酸，因此檸檬酸積累的最初階段并沒有阻斷TCA循環[19]。這與得到的結果一致，高產菌株中高濃度檸檬酸刺激增加順烏頭酸酶的表達。

（3）涉及脂類代謝的差異蛋白分析

在氧氣充足的條件下，脂肪酸被逐漸分解為乙酰CoA，最終徹底氧化為CO2和H2O，并釋放大量的能量，這是生物體內乙酰CoA的主要來源之一。?；鵆oA脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase，Acad）是一類用來催化細胞線粒體中脂肪酸β-氧化的第一步的重要的酶。由表3可知，其在菌株A.nigerYX-1217中的表達量比在菌株YX-1217G更高，發酵10 h差異倍數分別為1.346和2.266。甘油酯水解酶（esterase/lipase，Lps）隸屬于羧基酯水解酶類，能夠逐步的將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。在菌株A.nigerYX-1217中，Lps表達量相比在菌株YX-1217G更高，差異倍數增大到3.373。玉米中脂肪含量3%～5%，菌株A.nigerYX-1217在甘油酯水解酶的作用下，玉米淀粉液化液中的脂肪被降解為甘油和脂肪酸，脂肪酸再進一步進行β-氧化，最終生成乙酰CoA，作為檸檬酸生產的前體物質。

（4）涉及能量代謝的差異蛋白分析

生化代謝過程，如糖酵解、三羧酸循環和β-氧化，都會產生還原型輔酶NADH。此輔酶含有高電極電勢的電子，這些電子從NADH釋放出來，并通過一系列的酶傳遞給氧氣，最后以ATP的形式釋放出大量能量。呼吸鏈相關差異蛋白結果如表4。由表4可知，許多呼吸鏈相關蛋白在菌株YX-1217中表達量明顯增強，主要包括V型質子三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）的三個亞基A、B、E，和菌株YX-217G相比表達量增加，10 h的差異倍數分別為1.313、1.666、1.582。10 h的細胞色素b5、b-C1、C蛋白在菌株YX-1217中表達量增加，差異倍數分別為1.553、1.335、1.365。菌株YX-1217中標準呼吸鏈的蛋白及三磷酸腺苷酶的表達量增加，使得該菌株呼吸作用增強，在高產檸檬酸時提供維持生命的基本動力。

表4 涉及能量代謝的差異蛋白分析Table 4 Analysis of differential protein involved in energy metabolism

（5）菌株A.nigerYX-1217高產CA相關基因表達調控

為了闡明CA高產的機制，根據與CA生產的直接相關性，研究了菌株A.nigerYX-1217碳源代謝途徑的表達調控，如圖2所示。

圖2 兩株黑曲霉高產檸檬酸相關基因在10 h與40 h的表達調控Fig.2 Expression regulation of genes involving high yield citric acid in twoA.nigerstrains at 10 h and 40 h

由圖2可知，菌株A.nigerYX-1217中大多數和CA產生相關關鍵基因的表達水平顯著高于YX-1217G的表達水平。在高產菌株中，葡萄糖首先經糖酵解途徑生成丙酮酸；其次丙酮酸在丙酮酸羧化酶的作用下生成草酰乙酸，為檸檬酸提供前體物質，且脂肪酸代謝為檸檬酸的產生提供另一個前體物質乙酰輔酶A，二者在檸檬酸合酶的作用下生成檸檬酸；糖酵解途徑、脂肪酸代謝及三羧酸循環過程中生成的NADH和NADPH經呼吸鏈轉化為NAD+/NADP+，確保細胞內氧化還原狀態和能量代謝的平衡，否則由葡萄糖轉化為CA的代謝就會停止?？傊?，豐富的水解酶系、不受阻礙地中心代謝流、強大的電子傳遞鏈可能是A.niger YX-1217檸檬酸高產的原因。

3 結論

基于二維聚丙烯酰胺電泳（2-DE）分析菌株A.niger YX-1217和菌株A.nigerYX-1217G胞外分泌蛋白差異。質譜分析了6個差異明顯的水解蛋白，分別是酸性α-淀粉酶（An04g09890）、葡糖糖化酶（An14g02760、An04g06920）、精氨酸蛋白酶（An07g00950）、酰胺酶（An12g01020）和幾丁質酶（An05g01800）。菌株A.nigerYX-1217能分泌大量的胞外水解蛋白，使其主要原料——玉米淀粉液化液被充分利用，在發酵過程中使原料從濃稠變得稀薄，菌株長勢良好，產酸率提高。

將差異蛋白按照KEGG代謝數據庫進行分類，結果顯示與檸檬酸生物合成相關的酶在菌株A.nigerYX-1217中表達量顯著增加，如丙酮酸羧化酶（An04g02090）、檸檬酸合成酶（An15g01920）、甘油酯水解酶（An09g06390）、?；鵆oA脫氫酶（An17g01150）、V-型質子三磷酸腺苷酶亞基B（An02g02020）等。這些蛋白涉及糖酵解代謝、TCA循環、脂類代謝與能量代謝，這些蛋白的高效表達，是菌株A.niger YX-1217高產檸檬酸的原因之一。