乳酸菌細菌素對小鼠腸道菌群結構及代謝產物的影響

俞赟霞，王剛，趙建新，張灝，陳衛

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

人類的腸道菌群是一個密集、復雜和動態的微生態系統[1]，腸道菌群與宿主健康密切相關[2]。二者相互作用以維持微生態系統的功能穩定性。此外，腸道菌群產生的代謝產物(主要為短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs))是腸道菌群與宿主進行“交流”的物質基礎[3]。研究發現，乳酸菌可改善腸道環境，促進宿主健康，其產生的抗菌物質也是其發揮益生作用的一個重要因素[4]。乳酸菌產生的抗菌物質有有機酸[5]、過氧化氫[6]、雙乙酰[7]、細菌素[8]等。其中，細菌素是一類由核糖體合成，經或不經過修飾酶加工，最后分泌至細胞外的一類能抑制或殺死其他細菌的抗菌肽。

自Nisin[9]被發現以來，細菌素一直是多個科學領域的研究熱點。研究表明，有多種乳酸菌可產生細菌素，其具有狹窄或廣泛的抑菌譜[8]。近年來，國內外大多數關于細菌素的研究主要集中于以下4個方面：①產細菌素乳酸菌的挖掘以及細菌素抑菌能力的分析[10]；②將產細菌素乳酸菌運用于食品加工制造，以控制食品體系菌群及抑制致病菌生長[11]；③用作抗生素的替代物[12]，以在盡可能減少對腸道菌群干擾的條件下治療致病菌導致的感染，包括一些耐藥性致病菌[13]；④對細菌素進行生物工程改造[14]。而關于乳酸菌原位產細菌素對腸道菌群結構與代謝產物的影響仍少有研究。DZUNG等人[15]研究了5種產Ⅱ型細菌素的乳酸菌對腸道菌群結構的影響，結果表明乳酸菌是否產細菌素對門水平上的小鼠腸道菌群基本無影響，但屬水平上的腸道菌群結構發生了短暫但有利的改變。PAUL等人[16]的研究結果表明，除明顯減少了螺旋體門菌群，產與不產細菌素Abp118的唾液乳桿菌對小鼠與豬的腸道菌群結構在主要門水平上無顯著影響。前人研究均未涉及對腸道菌群代謝產物的影響以及抑菌譜大小對腸道菌群的影響是否存在差異。

本研究通過篩選產細菌素的乳酸菌，并選擇合適的相應不產細菌素的乳酸菌作為陰性對照株，以探索乳酸菌所產細菌素對宿主腸道菌群結構與代謝產物的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

本研究所用的乳酸菌及其他微生物菌株的編號、種屬、來源及培養方式分別見表1，表2。

表1 研究所用的乳酸菌菌株信息Table 1 Information of lactic acid bacteria used in this study

表2 研究中涉及的指示菌菌株信息Table 2 Information of indicator strains used in this study

1.2 試劑與儀器

1.2.1 培養基與試劑

胰酪胨大豆肉湯培養基(TSB)，MRS培養基，青島海博生物技術有限公司；胰蛋白酶(1∶250)，木瓜蛋白酶(>6 000 U/mg)，國藥集團化學試劑有限公司；胃蛋白酶(1∶15 000)，過氧化氫酶(>3 000 U/mg)，生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸鏈球菌素(Nisin，1 026 U/mg)，美國Sigma公司；膽鹽(OXOID)，英國OXOID公司；細菌基因組提取試劑盒FastDNA?SPIN Kit for Feces，北京聯立信生物技術有限公司；瓊脂糖凝膠DNA收試劑盒TIANgel Mini Purification Kit，天根生化科技(北京)有限公司；QuantTMdsDNA BR Assay Kit，美國Life Technologies公司；KAPA Biosystems Library Quantification Kit，美國KAPA Biosystems公司；TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit、MiSeq?Reagent Kit，美國Illumina公司。

1.2.2 儀器

電子天平，pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3750，日本Sanyo公司；冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；快速核酸提取儀FastPrep-24，美國MP公司；Bio-Rad T100 PCR儀，核酸電泳儀，凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司；厭氧工作站，英國依萊泰科公司；恒溫恒濕培養箱，上海森信實驗儀器有限公司；超凈工作臺，生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)，TRACE 1300，賽默飛世爾科技公司；MiSeq測序儀，美國Illumina公司。

1.3 菌株的培養

將待活化的乳酸菌以體積分數為2%的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃置于厭氧工作站中培養20 h，活化3代后將菌液離心(8 000 r/min，20 min)，取發酵上清液，調節上清液pH值為6.00±0.05[10]。經0.22 μm無菌濾膜過濾后得到無菌的發酵上清液，備用。

所用的指示菌按照表2中的條件進行活化培養，備用。

1.4 牛津杯雙層平板法測定乳酸菌的抑菌能力

制備含指示菌的固體培養基，調節菌濃度為106～107CFU/mL。在鋪有一層水瓊脂的平板中擺上牛津杯，小心倒入含指示菌的培養基，待其凝固后拔出牛津杯[17]。在形成的孔中加入100 μL制備好的無菌上清液，4 ℃條件下擴散4 h，隨后37 ℃靜置培養16～18 h，觀察并測定抑菌圈的大小。每個樣本做3個平行實驗，以MRS液體培養基(pH=6.0)作為陰性對照，Nisin溶液(活力為510 U/mL)作為陽性對照。

1.5 乳酸菌抑菌物質的分析

為測定抑菌物質對過氧化氫酶與蛋白酶的敏感性，將過氧化氫酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶分別溶解于50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0，胃蛋白酶為pH=2.0)中配成母液，加入至乳酸菌發酵上清液(pH調至7.0或2.0)中，使最終酶質量濃度達到1 mg/mL[11]。37 ℃水浴2 h后取出，100 ℃煮沸10 min使酶失活，將發酵上清液pH值調回6.0，按照1.4中的步驟測定其抑菌能力。

1.6 乳酸菌生物學特性的測定

1.6.1 乳酸菌代時的測定

將待測定的乳酸菌活化3代后，按體積分數為2%的接種量接種于適宜培養基中，混勻后分裝至25個無菌試管中，適宜條件下進行培養。指數期每隔30 min進行1次活菌計數，其余時間段為60 min測定1次(每次計數取1根試管)。繪制活菌數隨時間變化的生長曲線，按照公式(1)計算乳酸菌的代時(G)。

式中：t2與t1，指數期分別所取的時間點2與1，h；N2與N1，分別對應時間點2與1時的活菌數，CFU/mL。

1.6.2 乳酸菌耐酸耐膽鹽能力的測定

實驗方法參照翟齊嘯[18]并稍作修改，將胃蛋白酶溶于生理鹽水中(質量分數為0.85%)，調節pH至3.0，使其終質量濃度為3 g/L；將胰蛋白酶溶于生理鹽水中(質量分數為0.85%)，調節pH至8.0，使其終質量濃度為1 g/L，隨后加入牛膽鹽使其終質量濃度為3 g/L。人工胃、腸液經0.22 μm無菌濾膜過濾后備用。將活化3代后的待測乳酸菌離心(5 500 r/min，15 min)，重懸于人工胃液中并進行初始活菌計數，37 ℃培養3 h后再次測定其活菌數(期間每隔30 min搖勻1次)。將含菌人工胃液離心(5 500 r/min，15 min)，重懸于人工腸液中，37 ℃培養2、4 h后測定其活菌數(期間每隔30 min搖勻1次)，計算乳酸菌的存活率。

1.7 動物實驗

1.7.1 動物飼養及分組

實驗動物選擇5周齡的C57BL/6雄性小鼠30只，分為5組，每組6只。飼養環境溫度為20～26 ℃，濕度40%～70%，每周更換2次墊料。每日每只小鼠灌胃的菌濃度為5×109CFU/mL，灌胃體積為200 μL，即每只小鼠每天的灌胃菌量為1×109CFU。實驗分組及處理方式見表3。

表3 實驗動物分組及處理方式Table 3 Design of animal experiment

注：對小鼠進行乳酸菌灌胃前先適應1周。

1.7.2 小鼠糞便菌群結構的測定

動物實驗期間，收集灌胃3周后與停止灌胃1周后的小鼠糞便，采用16S rDNA擴增子測序的方法分析糞便菌群結構。按照FastDNA?Spin Kit for Feces試劑盒說明書來提取小鼠糞便的基因組。以提取得到的基因組為模板，經PCR擴增16S rDNA的V3、V4區(擴增片段長度為465 bp，上游引物341F：CCTAYGGGRBGCASCAG，下游引物806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT)。PCR反應體系組成為TaqMix，25 μL；341F，1 μL；806R，1 μL；模板，1 μL；ddH2O，22 μL。反應條件為：95 ℃，5 min；(95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，30 s)30個循環；72 ℃，7 min；12 ℃，10 min。經瓊脂糖凝膠電泳切取對應條帶，按照TIANgel Mini Purification Kit試劑盒說明書進行膠回收。

采用Qubit DNA濃度測定方法利用QubitTMdsDNA BR Assay Kit測定樣品濃度。根據DNA定量結果進行等質量濃度混樣，隨后按照TurSeq DNA LT Sample Preparation Kit 試劑盒說明書構建文庫，最后根據MiSeq Reagent Kit說明書經Illumina MiSeq測序儀上機測定[20]。

1.7.3 小鼠糞便短鏈脂肪酸的測定

實驗方法參考毛丙永[20]等并稍作修改：小鼠糞便經凍干后，稱取20 mg糞便置于EP管中，加入500 μL飽和NaCl溶液，浸泡30 min后用組織破碎儀破碎至無明顯顆粒狀。加入20 μL 質量分數為10%的H2SO4酸化，漩渦振蕩30 s，加入800 μL乙醚，振蕩混勻，提取短鏈脂肪酸，漩渦振蕩30 s后，14 000 r/min離心15 min。取上層乙醚相，在上清中加入0.25 g無水硫酸鈉，14 000 r/min離心15 min，將上清液轉移至棕色進樣瓶中，用GC-MS測定。

GC-MS測定條件按王剛等人[5]的方法進行，分析采用離子掃描模式(掃描范圍為m/z60、74、88、73、43、87、28)，采用外標法計算糞便中短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸)的含量(μmol/g)。

1.8 數據處理及分析

本研究所有數據分析均由GraphPad Prism 6、SPSS 19.0、Excel 2010處理完成。實驗結果以“平均值±標準差”表示，利用單因素方差分析(ANOVA)兩兩比較中的Duncan法進行分析，p<0.05則認為存在顯著性差異。

2 結果

2.1 乳酸菌的抑菌能力

7株乳酸菌的抑菌結果如表4所示。結果表明，4株乳酸片球菌中僅CCFM 28具有抑菌能力且抑菌譜較寬，其表現出對單核細胞增生李斯特菌ATCC 19114較強的抑菌能力(抑菌直徑為16.7 mm)。3株格氏乳桿菌中僅JCM 11657表現出抑菌能力，但其抑菌譜較窄，德氏乳桿菌乳亞種JCM 1557與CGMCC 1.2142對其敏感性最高(抑菌直徑為16.3 mm)。

表4 七株乳酸菌的抑菌能力Table 4 Antimicrobial ability of 7 strains

注：牛津杯外徑大小為8 mm。

2.2 乳酸菌的抑菌物質分析

過氧化氫酶與蛋白酶對乳酸菌發酵上清液的影響如表5所示。結果表明過氧化氫酶對CCFM 28與JCM 11657產生的抑菌物質基本無影響，但CCFM 28和JCM 11657的發酵上清液對1～2種蛋白酶較敏感(抑菌圈變為8 mm)。因此，可以判斷CCFM 28與JCM 11657產生的抑菌物質主要為細菌素。

表5 過氧化氫酶與蛋白酶對發酵上清液抑菌效果的影響Table 5 Effects of proteases and catalase on the antibacterial effect of supernatant

注：測定蛋白酶、過氧化氫酶對CCFM 28發酵上清液的影響，所用的指示菌為ATCC 19114，而JCM 11657用的則是JCM 1557。

2.3 乳酸菌生物學特性的分析

7株乳酸菌的生長曲線和代時測定結果分別見圖1和表6，耐酸耐膽鹽結果如圖2所示。綜合這3個實驗結果，發現ZT-45和JS-SZ-1-5的生物學性質分別與CCFM 28和JCM 11657最為接近。因此，選擇這2株菌分別作為CCFM 28和JCM 11657的不產細菌素陰性對照菌株。

圖1 七株乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curves of 7 strains

菌株編號菌株名稱代時G/hCCFM 28ZT-45X1339-1乳酸片球菌(P. acidilactici)0.4020.3530.3940.342JCM 11657JS-SZ-1-5JS-WX-9-1格氏乳桿菌(L. gasseri)0.6490.6330.906

圖2 七株乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力Fig.2 Resistance of 7 strains to gastric acid and bile salts

2.4 乳酸菌對小鼠生理的影響

2.4.1 小鼠飲水量和攝食量

動物實驗期間，按時測定小鼠的飲水量(每日)和攝食量(每周)，實驗結果見圖3-A、圖3-B。結果顯示，小鼠的飲水量與攝食量呈現出相似結果，CCFM 28組與ZT-45組明顯低于對照組、JCM 11657組和JS-SZ-1-5組(p<0.05)，而CCFM 28組與ZT-45組，JCM 11657組與JS-SZ-1-5組之間無顯著差異(p>0.05)。因此，從本結果來看，乳酸片球菌或格氏乳桿菌是否產細菌素對宿主飲水量、攝食量的影響無顯著差異，但菌種差異會引起飲水量與攝食量的變化。

圖3 小鼠的飲水量和攝食量Fig.3 Water and food intake of mice

2.4.2 小鼠體重

每周測定小鼠體重，計算其體重增量，結果如表7所示。從中發現組別之間基本無顯著差異(p>0.05)，但CCFM 28組與ZT-45組的體重增量基本低于對照組和格氏乳桿菌JCM 11657組和JS-SZ-1-5組。綜合2.4.1的結果，攝入乳酸菌可能會影響小鼠的攝食量與飲水量，但對體重增量影響較小，且可能與乳酸菌是否產細菌素無關。

表7 小鼠的體重增量Table 7 Increased weight of each mouse

注：a，b，c代表同一時間測定的5個組別體重增量的差異分析。

2.5 乳酸菌對小鼠腸道菌群的影響

2.5.1 乳酸菌對小鼠腸道菌群結構的影響

灌胃3周后(時間點1)與停止灌胃1周后(時間點2)的糞便菌群組成變化如圖4～6所示。

圖4 灌胃3周后不同組別的小鼠糞便菌群的門水平變化Fig.4 Changes in the phyla level of fecal microbiota in different groups after gavage for 3 weeks

圖5 停止灌胃1周后不同組別的小鼠糞便菌群的門水平變化Fig.5 Changes in the phyla level of fecal microbiota in different groups after 1 week of withdraw

圖6 兩個時間點收集的小鼠糞便菌群中厚壁菌門與擬桿菌門比例的變化Fig.6 Changes in the levels of Firmicuts and Bacteroidetes in feces of mice at 2 time points

結果發現，2個時間點測得的糞便菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的比例總和占腸道菌群總數的90%以上(圖4和圖5)。從厚壁菌門水平上看(圖6-A，圖6-C))，除CCFM 28組，2個時間點的其余組別均與對照組存在顯著差異(p<0.05)，表明ZT-45，JCM 11657，JS-SZ-1-5可顯著減少宿主腸道厚壁菌門的比例，而CCFM 28對其影響較小。另外，從擬桿菌門水平上看(圖6-B，圖6-D))，其呈現出與厚壁菌門類似的結果，ZT-45，JCM 11657，JS-SZ-1-5可顯著提高擬桿菌門的比例，而CCFM 28組與對照組之間的差異逐漸減小(從時間點1至2)。此外，CCFM 28組與ZT-45組之間存在顯著差異(p<0.05)，而JCM 11657組與JS-SZ-1-5組之間則無明顯差異(p>0.05)，這可能與乳酸菌所產細菌素的種類和抑菌譜的大小有關。

2.5.2 乳酸菌對小鼠腸道菌群代謝產物的影響

2個時間點測定的小鼠糞便中代謝產物(主要為短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸與丁酸)的含量結果如圖7所示。實驗結果表明，乙酸、丙酸、丁酸以及總酸的含量與對照組相比無顯著差異(圖7，p>0.05)，且CCFM 28組與ZT-45組，JCM 11657組和JS-SZ-1-5組之間亦不存在顯著差異(p>0.05)。此外，對比2個時間點所測得的相應SCFAs含量，發現二者之間無顯著差異(p>0.05)。由此說明，腸道菌群代謝產物與灌胃的乳酸片球菌、格氏乳桿菌是否產細菌素無關，且亦可能與以上兩個菌種差異無關。

圖7 灌胃3周后與停止灌胃1周后小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量的比較Fig.7 Comparison in the level of SCFAs in feces between the groups of gavage for 3 weeks and withdraw for 1 week

3 討論

細菌素被認為是乳酸菌發揮其益生作用的潛在因素之一[21]。近年來，國內外對產細菌素的乳酸菌對宿主腸道菌群的結構與代謝產物的影響則少有研究，特別是產細菌素的乳酸菌對腸道菌群代謝產物的影響，所產細菌素抑菌譜的大小對菌群的影響是否存在差異等還未有報道。

本研究采用牛津杯雙層平板法結合過氧化氫酶、蛋白酶處理等方法，得到兩株所產抑菌物質主要為蛋白或多肽類的乳酸菌——乳酸片球菌CCFM 28和格氏乳桿菌JCM 11657。并通過生長速率以及耐酸耐膽鹽能力選擇與CCFM 28和JCM 11657生物學性質最為接近的乳酸片球菌ZT-45與格氏乳桿菌JS-SZ-1-5分別作為其陰性對照組，以研究產細菌素的乳酸菌對宿主腸道菌群結構與代謝產物的影響。

結果顯示，乳酸片球菌組的飲水量和攝食量明顯低于對照組與格氏乳桿菌組，但產與不產細菌素組別之間無顯著差異。對于小鼠體重增量，乳酸片球菌組的體重基本低于對照組與格氏乳桿菌組，但無顯著差異。由此說明，對小鼠飲水量、攝食量以及體重增量的影響與攝入的乳酸菌是否產細菌素無關，但可能與菌種差異有關。此外，攝入乳酸片球菌后引起宿主飲水量與攝食量的改變，而體重未受影響可能與攝入的乳酸菌會影響宿主能量的吸收與利用有關[22]。

灌胃3周后與停止灌胃1周后的糞便菌群結構測定結果表明，小鼠腸道菌群主要由厚壁菌門與擬桿菌門構成。ZT-45，JCM 11657，JS-SZ-1-5可顯著減少宿主腸道厚壁菌門的比例，并提高擬桿菌門的所占比例，而CCFM 28對兩者的影響較小。有研究結果[15,24]表明，在體外Pediocin PA-1對21種常見的腸道菌群基本無影響，且產或不產細菌素Pediocin PA-1的乳酸片球菌P.acidilactici347在門水平上基本不影響Balb/c小鼠的腸道菌群，與本研究結果不一致的原因可能是研究模型的選擇，實驗動物品系的差異以及乳酸菌灌胃時間的長短。此外，CCFM 28組與ZT-45組之間存在顯著差異，而JCM 11657組與JS-SZ-1-5組之間無明顯差異，這可能與乳酸菌所產細菌素的種類和抑菌譜的大小有關[25]。因此，乳酸菌所產細菌素的種類與抑菌譜的大小可能會影響小鼠腸道菌群結構。

研究表明，腸道菌群能分解利用可溶性纖維產生有益代謝物質(主要為乙酸、丙酸、丁酸)以促進機體健康[23]。短鏈脂肪酸的測定結果顯示，產與不產細菌素組別之間，乳酸菌組與對照組之間，不同乳酸菌組別之間，兩個時間點的相應組別之間均不存在顯著差異。根據前人的研究結果[26-27]顯示，L.gasseriPA 16/8在MRS培養基中經發酵后可產生超過120 μmol/L的丁酸。產細菌素的P.acidilacticiUL5與對應的不產細菌素菌株相比，可在人類回腸末端模型中使菌群產生更多的乙酸與丙酸。但可能因研究模型與乳酸菌生長代謝環境的不同，使得本研究結果與前人發現有所不同。因此，盡管攝入乳酸菌對正常宿主腸道菌群的影響在門水平上有明顯變化，但不足以引起菌群代謝產物的顯著改變，表明正常宿主的腸道菌群具有較強的功能穩定性。

綜上所述，2對乳酸菌(CCFM 28與ZT-45，JCM 11657與JS-SZ-1-5)對小鼠飲水量與攝食量的影響與其是否產細菌素無關，但與菌種差異有關，而飲水量與攝食量的改變并未引起小鼠體重增量的明顯變化。乳酸菌是否產細菌素、所產細菌素的種類和抑菌譜的大小均可能會影響小鼠腸道菌群結構，但不顯著影響短鏈脂肪酸含量。