橙酒酵母的分離、篩選及鑒定

賈瑞楠，單萬祥，李永仙，鄭飛云，劉春鳳，王金晶，鈕成拓，李崎

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

甜橙是柑橘的一種，屬于蕓香科柑橘屬植物，在國內(nèi)具有廣泛的種植區(qū)域。甜橙含有多種對人體有益的營養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素、氨基酸、檸檬苦素、礦物質(zhì)等[1]。目前，甜橙主要以鮮食為主，易致甜橙產(chǎn)量呈季節(jié)性過剩，進而造成極大的浪費。市場上甜橙的加工產(chǎn)品種類較少，主要集中于橙汁、果醬等，其附加價值較低，出口渠道較為單一。將橙汁發(fā)酵為橙酒能夠保留橙汁中多種營養(yǎng)成分[2]，不僅豐富了甜橙產(chǎn)品市場，并有助增加其產(chǎn)品的附加值，進而有效幫助解決甜橙因季節(jié)性過剩造成的浪費問題。

近年來，以水果為原料，經(jīng)釀造具有獨特水果風(fēng)味的果酒受到越來越多消費者的青睞，然而橙酒在市場上比較少見，產(chǎn)品多采用葡萄酒酵母發(fā)酵或者直接用食用酒精加橙汁經(jīng)調(diào)配勾兌而成，因而產(chǎn)品無典型性、缺乏濃郁香氣、口感欠協(xié)調(diào)，風(fēng)味欠優(yōu)雅。對于果酒釀制而言，菌株發(fā)酵性能的優(yōu)劣直接關(guān)系到其代謝產(chǎn)物的種類和含量，因而對產(chǎn)品的口感和風(fēng)味起著非常關(guān)鍵的作用。不同的水果其物質(zhì)組成和含量也具有很大的差異，因而在發(fā)酵時對酵母菌株的性能需求也會不同。篩選出1株適合橙酒發(fā)酵的專用果酒酵母顯得尤為重要[3]。據(jù)文獻報道，潘訓(xùn)海[4]、陳瑤[5]以自然環(huán)境為分離源從菌種發(fā)酵性能方面篩選出適用于橙酒發(fā)酵的酵母，得到1株產(chǎn)酒精體積分?jǐn)?shù)達7.5%、殘?zhí)橇康陀? g/L、品評結(jié)果較好的菌株，取得了初步成果。熊元林[6]、羅佳麗[7]等側(cè)重于酵母耐受性的研究，得到1株對酸的耐受能力為pH 2.5、酒精耐受力為10%、氯化鈉耐受力為11%的酵母。目前對于橙酒酵母的研究多為發(fā)酵性能和耐受能力，尚處初步階段。缺少發(fā)酵風(fēng)味方向的橙酒酵母篩選工作。

本研究利用橙汁自然發(fā)酵，從中分離篩選得到1株酵母菌株，該菌株發(fā)酵能力旺盛，果酒口感協(xié)調(diào)，風(fēng)味柔和。文中同時對發(fā)酵風(fēng)味進行了分析和探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜橙、蔗糖，市售；偏重亞硫酸鉀(K2S2O5，分析純)，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；酵母基因組提取試劑盒，南京優(yōu)爾博生物科技有限公司；富集培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，氨芐1[8]；YPD培養(yǎng)基平板(g/L):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，瓊脂粉20。發(fā)酵培養(yǎng)基：橙汁，調(diào)整糖度為22 °Bx。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(PL2002)、AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；阿貝折光儀，上海豫光儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱(BSP-250)、低溫水浴槽，上海博訊公司；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國瓦里安(Varian)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種分離

將成熟的鮮橙榨汁后裝入無菌的三角瓶內(nèi)，于28 ℃靜置自然發(fā)酵。當(dāng)橙汁發(fā)酵液出現(xiàn)大量的氣泡時，取10 mL發(fā)酵液加入已滅菌的富集培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)48 h，取100 μL菌液逐級稀釋后涂布于含有氨芐的抗菌YPD平板上(每個梯度3個平行)，將稀釋的菌液均勻涂布在放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。典型的酵母菌落表面光滑濕潤，呈乳白色，有酒香味[9]。將培養(yǎng)后的平板中具有典型的酵母菌特征的單菌落挑出，進一步在YPD平板中進行二次劃線分離，將得到的單菌落分別經(jīng)YPD液體培養(yǎng)后于-80 ℃條件下保藏備用。

1.3.2 菌種初篩

吸取100 μL于-80 ℃條件下保藏的菌液入10 mL的YPD培養(yǎng)基中，活化18 h后，將菌液以3%(以橙汁體積計)的接種量接入橙汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，觀察橙汁進行杜式小管[10]的發(fā)酵情況。選擇產(chǎn)氣旺盛并且香氣優(yōu)良的菌株用以下一步復(fù)篩。

1.3.3 菌種復(fù)篩

將初篩保留的菌株于YPD培養(yǎng)基中活化18 h后以3%的接種量接入22 °Bx的橙汁中，于25℃恒溫發(fā)酵7 d。根據(jù)GB/T 15038—2006中的方法測定每株酵母發(fā)酵所得橙酒的酒精度[11]，每個樣品均做3次平行試驗，并進行初步的感官評定。

1.3.4 菌種的三級篩選

(1) 酵母pH耐受力實驗

以檸檬酸調(diào)節(jié)橙汁的pH值為2.5、3.0、3.5、4.0，采用杜氏管發(fā)酵，觀察各菌株在不同pH值條件下的杜氏小管產(chǎn)氣情況，每個樣品均做3次平行試驗。

(2) 酵母SO2耐受力實驗

將橙汁中添加不同量的K2S2O5以調(diào)節(jié)SO2質(zhì)量濃度為50、100、150、200、250 mg/L，采用杜氏管發(fā)酵，觀察各菌株在不同SO2質(zhì)量濃度下的杜氏小管產(chǎn)氣情況，每個樣品均做3次平行試驗。

(3) 菌株發(fā)酵液風(fēng)味分析[12-13]

將復(fù)篩得以保留的菌株進行活化，以3%的接種量接入含糖量22 °Bx的橙汁中，于25 ℃恒溫發(fā)酵7 d。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)半定量的方法分析檢測橙酒中的風(fēng)味成分，實驗以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)。

發(fā)酵液前處理萃取條件為：將3.0 g NaCl加入20 mL干凈無異味的頂空進樣瓶中，加入8 mL發(fā)酵后的橙酒，20 μL內(nèi)標(biāo)。45 ℃預(yù)熱5 min，萃取60 min。萃取結(jié)束后，250 ℃解吸附5 min。分析條件與參考文獻[13]相同。

1.3.5 菌株鑒定

從-80 ℃甘油管中取100 μL接種到已滅菌的YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、120 r/min培養(yǎng)18 h。取適量培養(yǎng)液離心1 min(12 000 r/min，4 ℃)，棄上清液，獲得適量菌體，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組。用酵母ITS通用引物擴增18S rDNA，PCR反應(yīng)條件與參考文獻[13]相同。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并進行DNA測序。并采用MEGA5.0軟件將測序所得的序列與GenBank中酵母菌的18S rDNA序列進行分析，獲得系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究選取了3種酵母菌：Saccharomycescerevisiae(39、KCCM200270、JCABSC21、CGMCC 2.1423),Candidacylindracea(NRRL Y-17506、JCM 9586),Schizosaccharomycespombe,Schizosaccharomycespombe(KCTC 7522)。

1.3.6 感官品評[14]

組織品評小組(具有相關(guān)專業(yè)背景的教師6人和碩士研究生14人組成)對橙酒進行感官品評，取平均值。主要從外觀、香氣、風(fēng)味和典型性4個方面評價。外觀:果酒清亮透明、有光澤無懸浮物和沉淀物，滿分20分；香氣:果香、酒香皆濃馥幽郁，諸香和諧純正，滿分30分；風(fēng)味:酒體醇厚豐滿或酒體爽口，風(fēng)味協(xié)調(diào)，滿分40分；典型性:具有明顯橙酒特征，具有濃郁發(fā)酵果酒香味，且酒香純正優(yōu)雅，滿分10分。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

PCA可以描述主要成分以及數(shù)據(jù)的趨勢和可能的分類，是一種有效的數(shù)據(jù)分析工具。本文使用SPSS 20.0軟件對不同酵母的發(fā)酵香氣進行PCA分析，并且對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和差異性分析，顯著性界值為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離

市售甜橙榨汁后，自然發(fā)酵2 d，將發(fā)酵液稀釋后在抗菌平板中進行分離純化，如圖1所示，共得到酵母菌株80株。

圖1 橙汁發(fā)酵液中富集的酵母Fig.1 Enriched yeast in orange juice fermentation broth

2.2 菌種初篩

采用杜氏小管發(fā)酵對分離得到的酵母進行初篩,初篩結(jié)果見表1。25 ℃恒溫發(fā)酵48 h后，觀察杜氏小管內(nèi)的產(chǎn)氣情況。結(jié)果顯示其中氣體全部充滿小管的有50株并且具有淡淡的酒香，這說明了這些菌株有較強的發(fā)酵能力；其中44株酵母的發(fā)酵氣味優(yōu)良，具有明顯的橙香。因此，保留發(fā)酵能力旺盛，發(fā)酵氣味良好的酵母菌株共44株。

表1 酵母初篩結(jié)果Table 1 Results of yeast screening

注：“-”表示氣體不足杜氏小管的1/3體積或發(fā)酵液有酸敗的氣味；“+”表示氣體超過杜氏小管的1/3或發(fā)酵氣味無酸敗氣味；“++”表示氣體超過杜氏小管的2/3或發(fā)酵氣味優(yōu)良。

2.3 菌種復(fù)篩

將初篩得到的44株菌株進行三角瓶發(fā)酵，25 ℃恒溫發(fā)酵7 d。發(fā)酵結(jié)束后采用比重瓶法[11]測定其酒精度。各菌株的發(fā)酵情況顯示較大的差異性，酒精度最高可達11.75%，最低可達2.52%。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于8%的菌株共有16株，經(jīng)初步的感官品評后，保留酒精度高，同時品評結(jié)果良好的酵母菌株9株，繼續(xù)進行三級篩選。

2.4 菌種的三級篩選

為了進一步篩選得到性能優(yōu)良可用于橙酒發(fā)酵的菌株，對復(fù)篩得到的菌株的耐酸能力，SO2耐受能力，及風(fēng)味物質(zhì)進行測定，并以商用葡萄酒酵母D254作為對照。

2.4.1 菌株耐酸能力實驗

橙汁pH值較低，本實驗為評價酵母在低pH值條件下的耐受性,選擇了4個梯度的pH值，結(jié)果如表2所示。實驗結(jié)果顯示復(fù)篩所得的酵母表現(xiàn)出較強的耐酸能力,和商用葡萄酒酵母D254相當(dāng),此輪篩選保留所有菌株。

表2 酵母對pH耐受性篩選Table 2 pH tolerance ability of different yeasts

注：“+”表示氣體超過杜氏小管的體積的1/2；“++”表示氣體超過杜氏小管的2/3；“+++”表示氣體充滿杜氏小管，表3同。

2.4.2 菌株耐SO2能力實驗

通常,SO2添加到果汁中可以起到殺菌效果,降低微生物對酵母的不良影響[15]。在葡萄酒的生產(chǎn)中，應(yīng)用SO2抑制各類雜菌的生長和繁殖。但過量的SO2會影響到酵母的生長,使葡萄酒的發(fā)酵周期延長,并使成品具有苦澀感。GB2760—2014中SO2(SO2殘留)的最高使用劑量為0.25 g/L[15]。實驗結(jié)果如表3所示,5、8、14、15、20、26號菌株對SO2的耐受性很好，在250 mg/L含量中仍發(fā)揮產(chǎn)氣功能,與商用葡萄酒酵母D254相當(dāng)。

表3 酵母對SO2耐受性篩選Table 3 SO2 tolerance ability of different yeasts

2.4.3 菌株發(fā)酵液風(fēng)味分析

果酒的風(fēng)味物質(zhì)對于果酒香氣和酒體的平衡至關(guān)重要，也是評價果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)。醇類、酯類、萜烯類、酸類、酚類化合物是果酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，它們賦予了果酒水果、花香等復(fù)雜的香氣[16]。將5、8、14、15、20、26、D254菌株進行三角瓶發(fā)酵，采用GC-MS半定量的方法檢測橙酒中的風(fēng)味物質(zhì)及其含量。表4為不同酵母發(fā)酵液的風(fēng)味物質(zhì)指標(biāo),將不同酵母發(fā)酵的各類風(fēng)味物質(zhì)指標(biāo)經(jīng)SPSS 20.0軟件作PCA分析，如圖2所示，主成分1的貢獻率達到73.5%，20號菌株、D254與主成分1有很高的正相關(guān)，5、8、14、15、20、26菌株與主成分1有很高的負(fù)相關(guān)，可以反映出20號菌株和D254與其他菌株的風(fēng)味差異顯著。

將有顯著差異的20號菌株與其他菌株比較，如表4所示，20號菌株發(fā)酵液各項風(fēng)味物質(zhì)含量高于5、8、14、15、26菌株發(fā)酵液。同時，相比于葡萄酒酵母D254,20號菌株發(fā)酵液的各類物質(zhì)增幅分別為總醇50.49%，總酯24.85%，萜烯類化合物31.67%，酸類化合物44.71%，酚類化合物59.30%，僅酮醛類化合物略低于D254的發(fā)酵液，經(jīng)SPSS差異顯著性分析后，20號菌株和D254菌株在酮醛類化合物質(zhì)量濃度上并無顯著差異。同時，7株菌株發(fā)酵橙酒的感官評分無顯著差異。保留20號菌株進一步分析。

表4 不同酵母發(fā)酵的橙酒的各類風(fēng)味物質(zhì)的質(zhì)量濃度Table 4 Concentrations of various flavors of orange wine fermented by different yeast

注：同一列中不同字母表示顯著差異(p<0.05)。

圖2 不同酵母發(fā)酵的橙酒的主成分分析Fig.2 Principal compoment analysis of orange wine fermented by different yeast

為進一步探討各風(fēng)味組分對于酒體的貢獻，本研究采用OAV值來評價香氣組分對于酒體的貢獻程度。OAV值是指揮發(fā)性物質(zhì)的質(zhì)量濃度與其閾值的比值[17]。OAV值大于1的物質(zhì)對于酒體有貢獻。OAV值越大，其對于酒體的貢獻程度越大[18]。橙酒共檢出近50種香氣組分，其中異戊醇、正庚醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸、芳樟醇、β-大馬酮、α-松油醇、月桂烯的香氣活力值大于1，這可能是橙酒風(fēng)味的的重要香氣組分。酯類物質(zhì)中辛酸乙酯、癸酸乙酯有濃郁的水果香氣，是果酒中重要的一類香氣物質(zhì)[19-20]，辛酸、乙酸苯乙酯具有花香香氣。比較20號菌株與葡萄酒酵母D254發(fā)酵液中的揮發(fā)性物質(zhì)的OAV值，如表5所示，20號菌株各種香氣組分均大于D254，所列成分中唯β-大馬酮的OAV值略低于D254。經(jīng)SPSS 20.0軟件作統(tǒng)計學(xué)分析，20號菌株與對照菌株D254發(fā)酵橙酒的異戊醇、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯的OAV值呈極顯著差異，癸酸乙酯的OAV值呈顯著差異。

表5 橙酒中揮發(fā)性成分的OAV值(僅列出OAV>1的香氣成分)Table 5 OAVs of odorants of different orange wines (odorants with OAV above 1.0 were listed)

注：**表示在p<0.01水平上極顯著差異；*表示在p<0.05水平上顯著差異。

綜合以上結(jié)果，20號菌株較適合橙酒的釀造，發(fā)酵后的橙酒口感清新，香氣馥郁。

2.5 菌種鑒定

20號菌的基因組DNA經(jīng)提取、PCR擴增及電泳檢測，如圖3所示，結(jié)果顯示良好。將擴增產(chǎn)物測序，所得的序列與GenBank中酵母菌的18S rDNA序列用MEGA5.0進行分析，獲得系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖4所示，20號菌株與釀酒酵母(S.cerevisiae)系統(tǒng)位置最為接近，說明20號菌株屬釀酒酵母屬。同時，測序結(jié)果經(jīng)與NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST序列比對，發(fā)現(xiàn)20號菌與1株釀酒酵母S.cerevisiae(ID：MG101836.1)具有100%的18S rDNA基因序列相似度，由此可確定20號菌株為釀酒酵母。

1-20號菌株；Y-陰性對照；M-Marker圖3 酵母PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.3 PCR products by agarose electrophoresis of yeast

圖4 基于18S rDNA測序構(gòu)建酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylodenetic tree of S. cerevisiae based on 18S rDNA sequencing

3 結(jié)論

選擇果酒發(fā)酵的酵母的必要條件包括良好的發(fā)酵性能，耐受性強，盡可能的生香能力，發(fā)酵產(chǎn)品香氣豐富協(xié)調(diào)。目前學(xué)者對橙酒酵母的篩選多側(cè)重于發(fā)酵性能和耐受性能。本文在借鑒前人的基礎(chǔ)上，在進行發(fā)酵性能和耐受力篩選后，針對發(fā)酵風(fēng)味對酵母進行了進一步篩選，得到1株發(fā)酵能力強、發(fā)酵后口感柔和、香氣濃郁的橙酒專用酵母，編號為20。

該菌株在含糖量22 °Bx橙汁中，產(chǎn)酒精能力可達11.75%，在pH 2.5，SO2250 mg/L的條件下仍具有良好的發(fā)酵能力，與文獻報道中[6]篩選得到的產(chǎn)酒精能力為11.4%，耐受pH 2.5的橙酒酵母相當(dāng)。在針對發(fā)酵風(fēng)味的菌株篩選中，20號菌株發(fā)酵液的醇類、酯類、萜烯類、酸類、酚類化合物的質(zhì)量濃度均高于商用酵母D254，且與D254在OAV值比較中，除β-大馬酮略低于D254，其余物質(zhì)OAV值均高于D254。經(jīng)18S rDNA測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，鑒定其為釀酒酵母(S.cerevisiae)。

橙酒專用酵母菌株的獲得有助于橙汁果酒的改善，為果酒的開發(fā)生產(chǎn)奠定了研究基礎(chǔ)。