新疆哈薩克族奶酪中潛在益生酵母菌的篩選

劉飛，郭孝敬，陳歡，史學偉，王斌，鄭曉吉

(石河子大學 食品學院，新疆 石河子,832003)

酵母菌在人類社會的發展中具有重要作用，不僅在醫藥學、環境方面的應用與日俱增[1]，在食品行業中，酵母菌在制作面包、奶酪、啤酒、葡萄酒等發酵型產品時，也有十分廣泛地應用，是極為重要的添加物[2]。它能夠在發酵過程中影響產品的風味[3]，并且具有潛在益生特性的酵母菌還能抑制病原菌微生物和梭狀芽孢桿菌等有害菌的生長[4]，并產生多種水溶性維生素，提高發酵乳制品的營養物質，為人體提供潛在益生功效[5-6]。目前，有相關報道從嬰幼兒糞便和乳制品中發現了具有潛在益生特性的酵母菌，如釀酒酵母(S.cerevisiae)和東方伊薩酵母(I.orientalis)等，它們能在低pH 值和膽鹽環境下生存，具備在人體胃腸道內生存的能力。將這些具有益生特性的酵母菌作為生物治療劑，能夠抑制或治療與抗生素相關的腹瀉和腸炎、預防和治療急性痢疾[7]、降低膽固醇[8]、抗輻射[9]和抗氧化[10]等益生功效。現今，國外的一些發酵乳制品中，如Kefir、Viili(酸乳酒)、Cantal(康塔爾坎特爾干酪)干酪、Camembert(法國卡門貝所產的軟質乳酪)干酪，均添加酵母菌賦予產品特殊的風味和較高營養品質[2]。但是也有一部分酵母菌是在食品制作過程中的污染菌、腐敗菌和有害菌，使產品品質下降并出現產氣、有酵母味或其他異味、引起質構變化、變色等[6,11]，因此我們要準確找出對人體有潛在益生性的酵母菌，使益生酵母菌在食品行業中發揮更大的作用。

我國境內的新疆哈薩克族牧民常年居住在新疆天山山脈腳下，長期飲用含氘量很少的冰川水和冰雪融水，擁有優質的奶源，在這種得天獨厚的條件下，悠久歷史的哈薩克族奶酪中蘊含了豐富多樣的酵母菌菌種資源，為新疆哈薩克族奶酪提供了獨特的風味和極高的營養價值。近年來，隨著我國乳品行業的迅速發展，市場的不斷擴大，從哈薩克族奶酪中篩選出具有潛在益生特性的酵母菌應用于乳制品加工中，開發新型乳制品迫在眉睫。新產品的開發將伴隨新疆地區乳品行業的又一個發展熱潮。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從新疆哈薩克族聚居的吉木乃(N)、阿勒泰(L)、伊寧(Y)、和分縣(F)地區，每地采集5塊奶酪樣品，用保鮮袋封裝后貼上標簽放入- 4 ℃的手提式冰盒內保藏，18 h內運回實驗室，在4 ℃下冷藏保存。選取出18株生長狀況良好酵母菌L5、Y1、Y36-6、N9、L1、H2、N6、L3、H6、H1、F3、F1、N香、N2、N1、H3、Y2、L4，從中篩選出具有益生特性的酵母菌。

1.2 試劑

葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司；蛋白胨，天津市北方天醫化學試劑廠；NaOH、HCl，天津市致遠化學試劑有限公司；膽鹽，天津永晟精細化工廠有限公司；胃蛋白酶，天津市福晨化學試劑有限公司；PBS磷酸緩沖液，天津市富宇精細化工有限公司。

1.3 培養基

YEPD液體培養基:酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L;

YEPD固體培養基:酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L;

膽鹽培養基:酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L、膽鹽1、3、5 g/L;

酸性培養基:酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、pH值為1.5、2.0、3.0、5.0、6.5;

LB培養基：蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、瓊脂15 g、pH 7.4～7.6、蒸餾水1 L；

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、瓊脂20 g、pH 7.0～7.2、蒸餾水1 L。

1.4 儀器及設備

高速冷凍離心機5810R(德國eppendorf儀器公司)，萬分之一天平BS224S(美國 Mettler Toledo 公司)，冷藏冷凍箱BCD-265F(榮事達集團)，全自動高壓滅菌鍋LAC-5040S(浙江新豐醫療器械有限公司)，標準型pH計pHS-3C(上海精密科學儀器有限公司)，光學顯微鏡CX21FS1(Olympus 公司)，紫外分光光度計722光柵(上海精密科學儀器有限公司)，超凈工作臺SW-CJ(蘇州安泰空氣技術有限公司)，智能生化培養箱Bnp-9272(上海精宏試驗設備有限公司)，水浴恒溫振蕩器SHZ-B(上海博訊實業有限公司)，PCR擴增儀TC-512(英國Techne公司)，水平電泳儀Power Pac Universal(美國BioRad公司)，凝膠成像系統Gel DOC XR(美國BioRad公司)。

2 試驗方法

2.1 潛在益生酵母菌的篩選

2.1.1 耐酸試驗

在篩選實驗中，將培養基調配為5種不同的pH值(1.5、2.0、3.0、5.0和6.5)來測試18株酵母菌的耐酸能力。將活化后的菌懸液以4%的接種量分別接種于5種不同pH值的液體篩選培養基中[12]，取pH值6.6為空白對照。在30 ℃，180 r/min的搖床上培養24 h 后測定OD600nm下的吸光度。

2.1.2 耐膽鹽試驗

將具有酸耐受性的酵母菌，接種在含豬膽鹽質量濃度為0、1、3、5 g/L的固體膽鹽培養基中，培養48 h后進行菌落平板計數法計算活菌數[2]。觀察酵母菌株在不同膽鹽質量濃度下的生長狀況，對膽鹽的耐受能力用公式(1)表示：

(1)

式中：ΔX,含有膽鹽的培養基中細胞增長數量;ΔY,不含膽鹽的培養基中細胞增長數量。

2.1.3 模擬人體溫度下的生長測試

將菌液接種到YEPD固體培養基上，每組2個平行，在30 ℃，180 r/min搖床上培養24 h后進行活菌平板計數。

2.1.4 模擬人體胃液環境

將篩出的酵母菌進行活化后，取30 mL酵母菌培養物在4 ℃，3 000g下離心10 min，細胞用滅菌后的PBS緩沖溶液(0.1 mol/L，pH 7.2：內含80 g/L NaCl)按1∶9比列稀釋。然后取0.1 mL懸浮液添加到1.0 mL模擬胃液中，模擬胃液[13]：含3 g/L胃蛋白酶和5 g/L NaCl，加HCl調節pH值為1.2。混合物在30 ℃、150 r/min搖床上培養2 h后，用紫外分光光度計測培養前后的OD600 nm值，計算菌數變化，用公式(2)表示：

(2)

式中：OD0h,沒有放入模擬胃液中的初始吸光度;ODth,在模擬胃液中培養若干小時之后的吸光度。

2.1.5 抑菌性試驗

人體胃腸道內菌種復雜，而益生菌的增多能夠抑制有害菌的生長，對人體健康有益。采用牛津杯法進行抑菌試驗，將篩出的酵母菌進行活化后調整菌液濃度為106CFU/mL備用。指示菌的菌液濃度也調整為106CFU/mL，吸取200 μL涂布于牛肉膏蛋白胨平板上。牛津杯滅菌后，用潔凈的鑷子輕壓于指示菌的平板上，使杯底緊貼于培養基上。每個培養基的牛津杯中加入200 μL酵母菌菌液，置于28 ℃恒溫箱培養24 h，測抑菌圈大小[13-14]。

2.1.6 菌體自動聚集能力及表面疏水性試驗

益生菌表面疏水性和自動聚集能力的強弱與其粘附性的強弱有密切關系，對益生菌在人體胃腸道內的生長存活有重要的影響，一般表面疏水性越強與自動聚集能力越高的細菌黏附力越強[15]。

(1)自動聚集能力測定

將YEPD培養基中過夜培養的酵母菌懸液以6 000 r/min離心10 min，并用0.2 mol/L的PB 緩沖溶液(pH 7.2)洗滌2次。將沉淀重懸于相同的緩沖液(2 mL)中，振蕩30 s，并在37 ℃下培養2 h。從上層取出懸浮菌液并等分試樣(1 mL)，在OD560nm對吸光度測定[16-17]，使用公式(3)：

(3)

其中：OD0和ODt分別為培養前后的吸光度。Au%<30%被認為是低的，在30%和60%之間為中，高于60%為高，一式三份進行測定。

(2)疏水性測定

當非極性溶液在極性水中會表現出不穩定的狀態，并引起分子的重新排列分布及一系列熱能(熵)的變化[15]，是疏水性的定義。通常將細胞與十六烷結合的能力作為間接評估酵母的疏水能力，測定方法由GONG等人提出[17]。方法如下：

①將10 mL酵母菌細胞培養物在4 000 r/min下離心10 min;

②棄去上清液，將沉淀物懸浮在酸化至pH 2.0的25 mL PBS(0.8 g/L , K2HPO4；0.68 g/L KH2PO48.77 g NaCl)中；

③每個酵母菌制備2個不同的樣品：對照(9.5 mL細胞懸浮液+ 0.5mL蒸餾水)和活菌樣品(9.5 mL細胞懸浮液+ 0.5 mL十六烷)；

④樣品振蕩10 s后靜置10 min；

⑤通過在30，60，90和120 min后在OD600nm處的吸光值來評估十六烷捕獲細胞的能力。將水相吸光度的降低作為細胞表面疏水性(H%)的度量，按公式(4)計算：

(4)

其中OD0和ODt分別為用正十六烷萃取前后的吸光度，該測定一式三份進行[16,18]。

2.2 菌株生理生化試驗及26S rDNA基因序列分析

(1)對篩選出的酵母菌進行糖發酵試驗和碳源、氮源同化試驗[19-20]；

(2)DNA提取按文獻[19]、[20]操作；

(3)PCR擴增。

反應體系：采用50 μL反應體系:基因組DNA模版2 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，2xTapPCR MasterMix25 μL，使用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3′) ITS1(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對應區域內的酵母菌DNA模版進行擴增，做好空白對照。

PCR反應循環條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性1 min，52 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，循環35次，72 ℃延伸10 min。

(4)測序

將擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳后，送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

2.3 數據統計及分析

對實驗結果進行3次重復測定，最終結果用均值+標準差的方式表現。先使用Origin 8.0軟件對數據進行處理，得到的結果比較采用SPSS(Vesion 19)中的ANOVA進行顯著性分析，采用鄧肯(Ducan)多重范圍檢驗法。

3 結果與分析

3.1 酵母菌在不同pH值下生長狀況

酵母菌在人體內的存活與pH值有密切關系，而在益生菌的篩選中通常也把菌株是否耐酸作為一個重要標準。表1中對18株菌在不同pH值下的生長狀況進行了顯著性差異分析，p<0.05說明各菌株有顯著性差異。

表1 各菌株在不同pH值下OD600nm處的吸光值Table 1 Absorbance of each strain at OD600nm at different pH value

續表1

菌株pH=1.5pH=2.0pH=3.0pH=5.0pH=6.5N20.12±0.014AB0.21±0.009AB0.19±0.011B0.51±0.016A0.64±0.021AY36-60.43±0.016F0.72±0.009J0.63±0.0124H1.22±0.0125G1.41±0.017HH60.15±0.0125BC0.51±0.008H0.64±0.011H0.91±0.029E1.19±0.016FH30.27±0.025D0.25±0.012BCD0.33±0.003F0.89±0.039E1.28±0.017GH20.13±0.0124AB0.23±0.0094ABC0.19±0.0125A0.71±0.0094D1.03±0.0205DL30.22±0.0125D0.19±0.011A0.31±0.0046E0.98±0.0169F1.22±0.0125FF30.13±0.0094AB0.22±0.027BCD0.29±0.0084D0.58±0.016B0.88±0.014CF10.19±0.0205C0.23±0.025CD0.31±0.009EF1.01±0.017F1.32±0.017H

注：同列數據中右上標字母相同者，表示差異不顯著(p>0.05)。

由圖1可以看出，在不同pH值下18株酵母菌的生長狀況，用OD600nm下不同菌株的吸光值反應其菌落數量的變化。菌株L1、Y2、N9、N2、H2、F3在5種不同pH值下的吸光值都比較低，且不同梯度間下降幅度較大，說明其在較低pH值下菌落數較少生長受抑制。而菌株Y1、L4、H1、Y36-6在不同pH值下均能夠正常生長有較高的生長活性，在pH=1.5的高酸條件下吸光值均大于0.4，酵母菌細胞數有一定的存活率，說明這4株菌具有較好的耐酸特性。其他菌株N1、L5、N6、N香、H6在pH值為1.5時吸光度有所下降，受到一定程度的抑制，但在pH值為2.0、3.0、5.0、6.5時均有一定的生長活性，說明這些菌株在低pH值條件下有一定耐酸性。

圖1 酵母菌在不同pH值下生長狀況Fig.1 Yeast growth conditions under acidic conditions

3.2 酵母菌在膽鹽固體培養基上的生長狀況

由圖2酵母菌在不同膽鹽質量濃度的生長狀況可知，N9、N6、N香、H3在3種膽鹽質量濃度下活菌增長率為0，受嚴重抑制，無法生長。菌株N1、L5、H6、L1、L3、F1的活菌增長率在3種膽鹽質量濃度下均小于22%，其中L5、H6、L3、F1在3 g/L膽鹽質量濃度下，菌株增長率分別為11.82%、13.01%、13.86%、21.32%,達到最大，在5 g/L質量濃度下增長率分別為3.94%、6.94 %、2.31%、17.89%，均有不同程度的下降，可以看出4株菌在1、3 g/L膽鹽質量濃度下有較好的生長具有一定的耐受性，在5 g/L質量濃度增長率降低生長活性受到一定的抑制。菌株L1、N1在1 g/L膽鹽質量濃度下菌株增長率分別為15.68%、6.07%，而在5 g/L膽鹽下增長率分別為13.51%、3.82%，增長率略微下降，說明L1、N1在5 g/L膽鹽下具有一定的生長力、耐受性。菌株Y1、L4、H1、Y36-6在不同膽鹽質量濃度下活菌增長率都在30%以上，14株菌中在3 g/L膽鹽質量濃度下Y36-6活菌增長率最高56.66%，5 g/L膽鹽質量濃度下Y1增長率最高49.08%，4株菌在高膽鹽質量濃度下不受抑制均有較強的生長力和耐膽鹽性，適合進行下一步的其他潛在益生特性研究。

圖2 酵母菌在膽鹽固體培養基上的生長狀況Fig.2 Yeast growth on bile salt solid medium注：圖中同一膽鹽質量濃度下不同字母表示差異性顯著(p<0.05)。

3.3 模擬胃液中酵母菌生長狀況

益生菌在人體胃腸道內存活時，對胃腸液的耐受能力是可變，而且具有菌株特異性。根據圖3中酵母菌的生長狀況顯示，10株菌在模擬胃液中培養0.5 h后，F1、L5、L1這3株菌的活菌下降率較高在15%以上，其余菌株下降率都較低在10%以下，但在培養3 h后，除了Y1、L4、H1、Y36-6這4株酵母菌數量略微降低，其余6株菌的活菌數迅速下降，下降率達到30%～55%。綜上可知長時間處在模擬胃液的條件下只有Y1、L4、H1、Y36-6有較好的耐膽鹽性，具有一定的存活性。

3.4 模擬人體溫酵母菌生長試驗

將篩出的10株酵母L5、F1、L4、Y1、H1、L3、H3、L1、Y36-6、N1置于37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h，觀察生長情況。由圖4酵母菌在37 ℃和室溫下的生長狀況可看出，在培養24 h后菌株H3的菌落數量最少，生長較緩慢,其余9株菌的菌落數均沒有較大的下降。可以看出在24、37 ℃情況下，這10株酵母菌均可以正常生長，說明37 ℃下并不會對菌株生長活性造成較大影響。

圖4 酵母菌在模擬人體溫下生長狀況Fig.4 Yeast in simulating the growth of human body temperature

3.5 益生酵母菌抑菌結果

通過表2抑菌試驗結果，得出L5在金黃色葡萄球菌上有抑菌圈，在大腸桿菌上沒有抑菌圈，不具有抑制大腸桿菌特性，F1、H3、L1在大腸桿菌和金黃色葡萄球菌上都沒有抑菌圈，不具備抑制有害菌能力。H1、Y1、Y36-6、L4在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌上都有抑菌圈。

表2 抑菌試驗結果Table 2 Yeast inhibition zone size

3.6 表面疏水性測定結果

圖5顯示了所研究菌株獲得的疏水性值，范圍為39.75%～82%，最高值對應于馬克斯克魯維酵母H1(82.21%)，而Y1釀酒酵母也有較高疏水性值71.59%。畢赤酵母屬菌株L4和Y36-6的疏水性值分別為39.75%、42.94%,具有中等能力的疏水性，由于它們種屬固有的凝集條件不同而顯示出不同能力的疏水性值。

圖5 表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity

3.7 菌體自動聚合能力測定結果

菌株H1、 Y1、 Y36-6、 L4的自動聚集能力如圖6所示。其中L4的自動聚合能力較高為59.99%，Y36-6較低為49.46%，4株菌都顯示出了中等程度的自動聚集能力。

圖6 菌體自動聚合能力Fig.6 Cell autolytic capacity

3.8 菌株生理生化及26S rDNA測序分析結果

由表3的生理生化試驗及圖7的發育樹結果分析，H1菌株屬于Kluyveromyces馬克斯克魯維酵母菌屬，與其相似度為99%，Y1菌株屬于saccharomycete釀酒酵母屬，與其相似度達到99%，Y36-6和L4都屬于Pichiakudriavzevii畢赤酵母屬，與其相似度達到99%。

表3 生理生化試驗結果Table 3 Physiological and biochemical test results

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性。

圖7 酵母菌發育樹Fig.7 Yeast developmental tree

4 結論

通過益生菌篩選試驗發現，在pH分別為1.5、2.0、3.0的條件下進行培養時，pH值越低，酵母菌生長活性受到的抑制越強，在pH為1.5時酵母菌生長活性最低，其中H2、F3、N2、Y2四種菌在3種酸度下均受到的較強的抑制，幾乎無法生長。在耐膽鹽試驗中，N6、H3、N9、N香4種菌無法正常生長，受到的抑制性較大。在模擬胃液和37℃的條件下，篩選出9株能夠在人體胃腸道存活的酵母菌，并對這9株菌進行了抑菌試驗。其中，L5、L3只在金黃色葡萄球菌的培養基上有抑菌圈，F1、L1、H3在兩種指示菌的平板上均沒有抑菌圈，只有H1、Y1、Y36-6、L4四株菌可以在兩種指示菌上看到明顯的抑菌圈。經過以上的益生特性篩選試驗后得到H1、Y1、Y36-6、L4這4株菌為潛在益生酵母菌，并對4株菌的疏水性及自動聚集能力進行測試后發現，菌株H1、Y1具有高度疏水性，Y36-6、L4具有中度疏水性，且4株菌都具備中等自動聚集能力，說明它們都具有良好的黏附性在胃腸道內能有較好的存活能力。對4株酵母菌DNA測序，將測序結果比對分析后得出，菌株H1屬于馬克斯克魯維酵母菌屬，菌株Y1屬于釀酒酵母屬，與其相似度達到99%，Y36-6和L4都屬于畢赤酵母屬，與其相似度達到99%。后期將對篩選出的4株具有潛在益生功能的酵母菌，進行益生功能性乳產品的研制，對其在實際應用中的抗氧化性和益生活性等方面進行研究。