醬香型大曲的揮發性組分時空性特征的分析

李登勇,黃鈞,丁曉菲,金垚,吳重德,周榮清,2,3*

1(四川大學 輕紡與食品學院，四川 成都，610065) 2(皮革化學與工程教育部重點實驗室，四川 成都，610065) 3(國家固態釀造工程技術研究中心，四川 瀘州，64600)

大曲是中國傳統白酒生產中重要的發酵劑[1]，與白酒的品質和風味特征密切相關。依據制曲的最高品溫和產品的芳香特征主要分為清香、濃香、醬香型3種類型[2]。這3種不同類型大曲的微生物群落具有多樣性差異的特點[3-4]，其揮發性組分組成也具有差異顯著特點，且存在一定的相關性。例如醬香型大曲中吡嗪和芳香族組分[13]含量較高，這些組分對醬香型大曲酒獨特芳香產品風格的形成具有重要的作用[5-11]，主要是其所含優勢菌屬Bacillus的貢獻。醇類組分是清香和濃香型大曲的主要揮發性組分之一，乙酯類和甲酯類組分則分別也是前者和后者的主要揮發組分之一[1,12]。對影響大曲群落多樣性因素的研究結果揭示了制曲溫度是最重要的影響因素，且其作用強于地理環境[15-16]。

針對川黔赤水河流域眾多醬香大曲生產企業生產工藝類似，但基酒風味特征差異顯著的現象，本文描述了以同企業產地和生產場地、同產地不同企業和陳曲時間不同的醬香型大曲為對象，通過分析其理化參數和揮發組分的差異，揭示其時空性特征。旨在為研究醬香型大曲代謝組分及群落多樣性的相關性，以及時空性對基酒酒體特征的影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

MBQ和MEQ分別采集于某著名醬香型白酒生產企業在遵義市仁懷市茅臺鎮和習水縣習酒鎮的生產基地。LEQ和LGQ分別來源于中國四川省古藺縣二郎鎮某醬香型白酒企業黃荊壩和二郎生產基地，其中MEQ和LHQ的生產場地僅一河之隔。XXQ和XTQ是古藺縣太平鎮某醬香型白酒企業分別存儲了6個月和3個月的醬香型大曲。

鑒于大曲不同部位的特征性揮發性組分可反映出培養條件所產生的影響，從而將大曲分為曲表和曲心。具體操作方法為取大曲表皮 0～3 cm的樣品為曲表樣品，曲中心向外0～3 cm部分的樣品為曲心樣品，混合均勻后，過20目篩，于-20 ℃保藏待測。因為茅臺原產曲曲塊香味及顏色與其他類型大曲不同，將曲心黑色部分單獨分離，命名為黑臺層，并將曲底(底部0～3 cm)的樣品也收集分析。各樣品的信息如表1所示。

1.2 儀器設備

表1 各樣品信息及簡稱Table 1 Informaiton and abbreviation of the variousSauce-flavor Baijiu Daqu samples

氣相色譜質譜聯用儀(Trace GC Ultra-DSQⅡ)，美國Thermo Fisher Electron；固相微萃取頭(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)，美國Supelco公司；恒溫磁力攪拌器(85-2)，上海雙捷實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水分、發酵力、糖化力、酯化力、液化力的測定

參考ZHAO等[17]使用的方法。

1.3.2 揮發性物質的萃取

參考DING等[18]使用的方法。準確稱取1.00 g樣品于25 mL頂空瓶中，加入20 μL 2-辛醇甲醇溶液 (0.82 g/L)密封。然后將頂空瓶置于恒溫磁力攪拌器中60 ℃預平衡15 min。將固相萃取針(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)插入頂空瓶中并暴露微萃取頭，萃取吸附45 min。

1.3.3 GC-MS解析條件及揮發性物質的定性、定量

分析方法參考DING等[18]使用的方法。解析條件：進樣口溫度設為250 ℃，以高純氦氣為載氣，流速為1 mL/min，以分流模式進行,分流比為10∶1。以40 ℃為程序性升溫的起始溫度，維持5 min，然后以5 ℃/min的速度升溫至220 ℃，維持5 min。質譜電離方式為EI，電子強度為70 eV，離子源溫度為230 ℃，轉換線溫度是250 ℃，色譜掃描范圍是40～400 amu。

定性、定量分析：將未知揮發性物質與標準質譜數據文庫NIST05中的標準物質質譜進行對比，將SI和RSI均大于80%的比對結果作為初步定性結果，然后根據未知物質組分在HP-innowax色譜柱上的保留時間和在該條件下C7～C30直鏈烷烴的保留時間計算未知組分的保留系數。將保留系數與采用相同色譜柱的文獻或者數據庫中已有的保留指數做對比來校正初始定性結果。將影響因子視為1，對揮發性物質進行半定量分析。所有的樣品重復3次平行，結果表示為平均值±標準偏差。使用方差分析 (ANOVA)對不同樣品間揮發性物質含量進行顯著性分析(p<0.05)。所有統計分析均使用SPSS 17.0和Origin 8.50。

2 結果與分析

2.1 理化性質的差異

如表2所示，MBQ最大的特點是酸度低，曲表的發酵力、酯化力高，但曲心的則較低。各類大曲曲心和曲表的理化指標的差異也因來源而異。酸度、發酵力、酯化力、糖化力、液化力，除LEQ、LGQ、MBQ和XTQ、XXQ、XTQ外，都是曲心低于曲表的。除感官評判以外，通常理化指標也是用于衡量釀酒大曲質量的重要參數[19-20]。與之前的研究結果類似，各樣品間的理化參數，尤其酯化力、糖化力、液化力等的時空性特征較明顯[18]。生產區域間大曲樣品及部位間樣品的理化性質差異顯著。茅臺原產地的大曲水分高，酸度低，且曲表的酯化力、糖化力和液化力較高；二郎鎮區域產大曲則含水量低，酸度高，而且其發酵力高于鄰近兩個區域 (茅臺鎮和太平鎮)的樣品。同企業不同生產場地的樣品的糖化力和液化力的差異也顯著，如LEQ的高于LGQ。增長陳曲時間(3個月)使大曲的糖化力增高，液化力和酸度降低，曲心的發酵力和酯化力增高，而曲表的發酵力和酯化力降低。

2.2 各樣品間揮發組分的時空性特征

從14種樣品中共檢出了113種揮發性組分，根據其化學結構特點，分為酯類(43種)、含氮化合物 (16)、酸類 (6)、醇 (10)、芳香族 (18)、酮 (6)、呋喃 (1)、醛類 (9)、酚類 (3)等9類組分。在不同樣品中相對豐度如圖1所示。

2.2.1 醬曲不同部位的揮發性組分的區別

MBQ的不同部位的樣品不僅總揮發性組分含量有差異，而且各類揮發性物質含量也具有較大差異。從MBH、MBC、MBA、MBD檢出的揮發組分的數量分別是56、60、52、59，其總含量大小順序是MBH(926.41 μg/kg)>MBC(484.86 μg/kg)>MBA(295.51 μg/kg)>MBD(125.37 μg/kg)。各類風味物質的相對含量也因部位而異。MBH中含氮化合物和芳香族組分分別是52.80%和17.78%，MBC的芳香族和酯類組分分別是42.00%和32.64%。MBD和MBA中的酯類的相對含量分別是53.64%和58.49%，芳香族分別是22.20%和12.24%，而含氮化合物分別是10.60%和18.84%。這些部位差異可能是大曲不同部位間溫度、濕度和氧氣梯度差所致的群落多樣性及代謝途徑的差異所致。對于其他醬香型大曲樣品，曲心和曲表間主要揮發性物質種類相同，但曲心中含量顯著高于曲表。這可能是造成茅臺鎮醬香型白酒與其它類型醬香型白酒風味差異的原因之一，例如茅臺鎮白酒中2.3.5.6-四甲基吡嗪和2.3-二甲基吡嗪的含量較高[10]。

圖1 各類揮發性組分在各樣品中所占的比例Fig.1 Various volatile compounds proportion among different samples

2.2.2 地域環境對醬曲揮發性組分的影響

MBQ和MEQ系相同企業生產在不同區域生產，MBH、MBA、MEH、MEA分別檢出了56、52、62、61種不同的揮發組分。MEH的總含量比MBH低41.97%，醇、含氮化合物和酮類組分在MBH的含量分別較MEH高70.88%、58.15%、90.45%，同時在MBA中分別比MEA的高24.03%、75.12%、48.83%。MEQ的曲心和曲表樣品的酯類組分較MBQ的分別高198.60%和104.58%，其中MEH棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯分別比MBH的高122.61、52.29、57.63 μg/kg，但是MBH中的1-辛烯-3醇、2.3.5-三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2.5-二甲基-3-丁基-吡嗪、4-乙烯基-1,2-二甲基苯酚分別比MEH高 (圖2-a)。MEA中高級脂肪酸酯類組分的含量高于MBA，尤其棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯(圖2-b)。致使MBQ和MEQ揮發性組分組成與含量差異的主要原因可能是微生物群落多樣性的差異所致。前者的優勢微生物主要是芽孢桿菌、醋酸桿菌、乳酸菌、漢遜酵母、假絲酵母、畢赤酵母、曲霉屬真菌、毛霉屬等[21]，而后者則是芽孢桿菌、放線菌、葡萄球菌屬、曲霉屬、嗜熱真菌屬等[22-23]。

2.2.3 相同地域不同地點及不同企業對醬曲揮發性組分的影響

LGQ和MEQ系相同地域不同生產企業生產。與LEH相比，MEH中酯類的含量比LEH中多63.49%，其中MEH中棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯分別比LEH中多70.15、31.81、21.63 μg/kg (圖2-c)。而LEA和MEA之間揮發性物質差異較小，其中兩樣品之間揮發性物質含量差異相對較大的是酯類和吡嗪化合物(圖2-d)，兩種大曲的主要差異可能來源于生產技術和原材料之間的差異。LEH、LEA、LGH、LGA分別檢出了70、60、68、73種揮發性組分，LEQ的總揮發性組分含量高于LGQ，兩種大曲曲心與曲表間的含量基本相同。

LGQ和LEQ系相同地域相同企業在不同地點生產的大曲，LEQ和LGQ的主要揮發性組分都為酯類，但LEQ中酯類組分的含量是LGQ的3.50倍，其他類型中的揮發性物質在LEQ中的含量也略高于LGQ。如圖2-e所示，LEH和LGH中含量差異較大的揮發性物質主要是長鏈脂肪酸甲酯、吡嗪類、苯乙醇，其中LEH中的棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯、苯乙醇分別較LGH高75.45、23.87、28.2 μg/kg。如圖2-f所示，LEA和LGA中差異較大的揮發性物質主要是也長鏈脂肪酸酯、吡嗪類、苯乙醇，其中LEA的棕櫚酸甲酯、油酸乙酯、亞油酸甲酯的含量分別較LGA高115.58、39.83、51.67 μg/kg (圖2-f)。

圖2 醬香型大曲樣品間主要揮發組分之間的差異Fig.2 Difference of major volatile among different Sauce-flavor Baijiu Daqu

2.2.4 不同時間對醬曲揮發性組分的影響

延長3個月陳曲時間，曲心和曲表均有組分形成和消失。曲心的酯、酸、酚、芳香族組分含量略增加，其中脂肪酸甲酯和苯乙醇增加最為明顯，而含氮化合物、芳香族、醛類的含量減少，其中四甲基吡嗪含量減少最為明顯(圖2-g)，曲表中酯類和含氮化合物含量減少，其中油酸甲酯、亞油酸甲酯、四甲基吡嗪、己酸乙酯、豆蔻酸甲酯的含量減少，醇、酮、芳香族類組分含量增加(圖2-h)。這些變化可能與大曲陳曲過程中微生物群落多樣性及活性變遷有關[24]。

2.3 各樣品間組分聚類分析

在113種揮發性組分中，有50種揮發性組分在6種大曲中都被檢出，包括酯(19)，酸(1)、醇(2)、含氮化合物(13)、芳香族(15)等5類化合物。其中是2.5-二甲基-3-丁基吡嗪、三甲基吡嗪、4-VG、苯乙醇等11種揮發性物質含量豐度較高，這些組分在醬香型白酒也是主要組分[13]。對11種主要的揮發組分的熱圖分析表明(圖3)。MBQ、LGQ及XXA聚為一大簇，4-VG、2.5-二甲基-3-丁基吡嗪、2-羥基-6甲基苯甲醛、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪等的含量相對較高，尤其是在MBH中含量最高。其中MBA和MBH為子族，LGH和LGA為相同的子簇。而另一大簇包括MEQ、LEQ、XTQ和XXH，其中MEH和MEA聚為相同子簇，而其余的樣品如LEA和LEH未能聚在相同子簇，XXH、XTH、XTA等樣品也未能聚在相同簇中，該大簇中油酸甲酯、亞油酸甲酯、棕櫚酸甲酯的含量較高。以上分析表明空間差異是造成醬香型大曲中11種主要的揮發性物質含量差異的主要原因，其次是時間因素。

圖3 基于11種主要的揮發性組分對不同醬曲樣品的熱圖分析Fig.3 Heatmap analysis baed on the 11 major volatiles in Sauce-flavor Baijiu Daqu

基于揮發性物質對14個醬香型大曲樣品的PCA的結果(圖4)顯示。MBH因總揮發性組分含量明顯高于其他樣品，且芳香族和含氮化合物組分豐度最高，其荷載則分布在PCA1 (42.7%)。MBC因苯乙醇含量最高，則與其他樣品間的距離較遠。MBD、LGH、LGA、MBA等樣品間揮發性組分類似，則距離相近，聚為一簇。類似地，MEA和MEH中酯類組分豐度較高距離相近，而LEQ和XTQ則有較近的距離。由此可見，基于揮發性組分對各醬香型大曲樣品的PCA與豐度熱圖均能清晰地辨析醬香型大曲的時空性特征。

圖4 基于風味物質的各樣品的主成分分析(PCA)Fig.4 Principal components analysis (PCA) based on the volatiles for different Sauce-flavor Baijiu samples

3 結論

對來源于不同生產地、企業和陳曲時間的6種醬香型大曲理化參數及揮發組分組成特征研究的結果表明，大曲揮發組分特征具有顯著的時空性特征。含氮化合物、芳香族、酯類等3類化合物是主要的揮發性物質。棕櫚酸甲酯、四甲基吡嗪、2.5-二甲基-3-丁基吡嗪、苯乙醇等11種不同的組分為主要組分。總揮發性組分含量和含氮化合組分與芳香族揮發組分的豐度是辨析產地及特點的重要參數。陳曲過程不僅伴隨著主要組分含量的減少，且組分數量變遷。基于PCA和聚類分析等分析方法能夠有效的辨析醬香型大曲揮發性組分的時空特性。