湖北地區(qū)豬瘟病毒流行株E2基因的序列測定與分析

郭 銳，田永祥，周丹娜，劉 威，段正贏，楊克禮，劉澤文，袁芳艷，高 婷

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，湖北 武漢 430064；2.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；3.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)湖北科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，湖北 武漢 430064；4.動(dòng)物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064）

豬瘟（Classical swine fever,CSF）是由黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）的豬瘟病毒（CSFV）所引起高熱、出血和高死亡率為特征的接觸性傳染病[1]，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列入須申報(bào)的動(dòng)物傳染病目錄，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。我國1954年成功研制出豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），推廣應(yīng)用至今，較好地控制了豬瘟的大規(guī)模暴發(fā)和流行，免疫保護(hù)率一直在90%以上，但該病近幾年在全國各地呈零星散發(fā)性流行，臨床表現(xiàn)日趨復(fù)雜，必須引起我們獸醫(yī)工作者的足夠重視。

CSFV基因序列全長約12.3 Kb，病毒基因序列兩端各有一個(gè)非編碼區(qū)（5'-UTR和3'-UTR），非編碼區(qū)中間僅有一個(gè)大的開放閱讀框（ORF），能夠編碼3 898個(gè)氨基酸，其可構(gòu)成12種蛋白質(zhì)，有4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（C、Erns、E1、E2）和 8 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B）。E2蛋白是CSFV最重要的結(jié)構(gòu)性蛋白，也是最重要的功能性蛋白，是目前研究最為透徹的蛋白。在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，E2蛋白能與宿主細(xì)胞表面相應(yīng)的特異性受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒的侵入。雖然E2蛋白是CSFV最重要的保護(hù)性抗原，但它也是CSFV編碼的所有蛋白保守性最差的一個(gè)，含有A、B、C 3個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域。這些區(qū)域中的一些與中和性密切相關(guān)的氨基酸序列或位點(diǎn)有著極高的突變頻率，從而對E2蛋白整體的免疫原性產(chǎn)生影響，這可能也是造成疫苗株與野毒株免疫原性差異的根本原因。本試驗(yàn)旨在通過分析E2基因的遺傳變化規(guī)律，從而了解湖北省地區(qū)CSFV流行毒株的變異情況，為豬瘟綜合防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年3月29日至4月21日在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 材料

湖北省內(nèi)疑似CSFV發(fā)病豬場，無菌采取剖檢豬的脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)等作為檢測CSFV的材料；pMD18-T載體、DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、rTaq DNA、E.coli DH5α聚合酶購自大連寶生物工程有限公司；RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 病毒cDNA的合成

按照RNA提取試劑盒說明操作提取病毒RNA，再利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并-20℃保存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

引物參照GenBank已公布的HCLV株、Shimen株等CSFV參考毒株的E2基因組序列進(jìn)行，上游引物 P1：5'-GCACAGGTCGTAAAGTTAGC-3'；下游引物 P2：5'-GTTGGATGTCAAAGCTGGTC-3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1 489 bp，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 CSFV E2基因的擴(kuò)增

用1.3提取的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系體積為50 μL，其中10 μmol/L濃度的上下引物各 1 μL，模板 5 μL，2×EasyTaq PCRMix 25 μL，剩下添加 ddH2O 至 50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；95℃ 變性 30 s，62℃ 退火 30 s，72℃延伸 1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸 10 min。

1.6 CSFV E2基因的克隆及序列分析

將E2基因片段PCR產(chǎn)物回收，然后連接pMD18-T載體過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化用DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。從平板上挑取單菌落接種于3 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。用菌液提取質(zhì)粒，進(jìn)行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定。將酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送到上海生工生物工程有限公司測序，利用基因分析軟件MegAlign 5.0對測序結(jié)果進(jìn)行分析，參考毒株信息見表1。

表1 參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 CSFV-E2基因的擴(kuò)增

進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到1 489 bp的片段，與預(yù)期相符，見圖1。

圖1 CSFV-E2基因PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

2.2 HBWH-2017-E2基因片段的基因氨基酸序列同源性分析

將HBWH-2017株和GenBank中公布的27個(gè)不同亞型CSFV毒株的E2基因氨基酸序列用Me gAlign 5.0軟件進(jìn)行分析，同源性在86.0%~96.0%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株與湖南HNLY-2011株同源性高達(dá)96%，親緣關(guān)系最近，屬于同一分支2.1c亞型（圖2）。

圖2 HBWH-2017-E2基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

CSF是一種高度接觸性、急性傳染病，以高發(fā)病率、高死亡率、全身各臟器出血、高熱稽留為主要特征，曾對我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。自從20世紀(jì)50年代我國科學(xué)家研發(fā)豬瘟兔化弱毒疫苗被廣泛應(yīng)用以后，CSF對我國養(yǎng)豬業(yè)的危害已顯著降低。事實(shí)證明我國所使用的豬瘟兔化弱毒苗已經(jīng)成為目前世界公認(rèn)的最有效的豬瘟疫苗。但從近幾年來全國各地的調(diào)查數(shù)據(jù)來看，CSF在我國并沒有根除，這可能是由于長期使用疫苗產(chǎn)生的高免疫壓力，迫使毒株向遠(yuǎn)離疫苗株方向進(jìn)化[2]。

CSFV的E2糖蛋白是誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要保護(hù)性抗原。因此在CSFV的分子流行病學(xué)調(diào)查過程中常通過對其全基因或E2基因特定區(qū)域核苷酸序列及編碼氨基酸序列進(jìn)行測定和變異分析，然后構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹追溯其起源。其中CSFV的E2蛋白N2端上第690~866位氨基酸為其主要抗原決定區(qū)，文獻(xiàn)報(bào)道如第705、710、713~719、724、725、727、732 和 734 位的氨基酸發(fā)生變異，可導(dǎo)致特定單抗不能將其識別，即這些位點(diǎn)氨基酸與抗原決定簇有關(guān)[3-5]。本研究結(jié)果表明，與參考毒株HCLV株、Shimen株等27株毒株的E2基因編碼氨基酸序列相比，HBWH-2017株屬于2.1c亞型毒株，上述所說的11個(gè)氨基酸位點(diǎn)全部發(fā)生了變異，其中較為保守的713~719位點(diǎn)GGLTTTW，也變異為GGLYGCP。這些位點(diǎn)氨基酸變異可能導(dǎo)致抗原性差異，從而致使CSFV逃脫兔化弱毒株的免疫保護(hù)，導(dǎo)致免疫失敗。要明確2.1c亞型豬瘟病毒的抗原性和毒力的變化及受到哪些氨基酸位點(diǎn)影響，還需進(jìn)行更加深入的試驗(yàn)研究。

綜上所述，目前我國CSFV流行毒株基因型主要有3種亞型，如山東地區(qū)流行2.1d亞型、遼寧地區(qū)2.1b亞型、福建地區(qū)2.1b和2.1c亞型、廣西和廣東地區(qū)2.1b和2.1c亞型、陜西地區(qū)2.1a亞型、湖南地區(qū)2.1b等，從主總體來看2.1b、2.1d、2.1c毒株已經(jīng)成為我國現(xiàn)階段CSFV的主要流行毒株。雖然目前我國流行的CSFV毒株以2.1b亞型占主導(dǎo)地位，但2.1c亞型新毒株的流行區(qū)域有不斷擴(kuò)散的趨勢，今后我們應(yīng)該加強(qiáng)對2.1c亞型毒株的監(jiān)測和防控。