甘薯半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因（CPI）克隆及功能初步分析

洪子茜，楊秋萍，侯馨怡，鄧 鴿，張 立，費(fèi)雪婷，胡又文，雍 彬，邵歡歡

（四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101）

植物蛋白酶抑制劑(protease inhibitors， PIs)是一類分子量較小的蛋白或多肽，PI可以與蛋白酶的變構(gòu)部位或活性區(qū)域結(jié)合從而抑制蛋白酶活性，因此可以抑制食草類昆蟲(chóng)消化道中蛋白酶的活性，降低昆蟲(chóng)對(duì)植物的攝食量，影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)和發(fā)育，甚至可以導(dǎo)致昆蟲(chóng)的死亡，是參與植物防御機(jī)制的重要成分之一。PI在調(diào)節(jié)蛋白酶的活性以及蛋白質(zhì)的代謝方面有著難以代替的作用，是生物體內(nèi)免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在植物儲(chǔ)存淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的器官（如塊莖、種子、球莖等）中，PI含量甚至高達(dá)總蛋白的10%。目前通過(guò)現(xiàn)代分子分離技術(shù)已經(jīng)從50多種植物材料獲得蛋白酶抑制劑，其中以植物種子含量最多和最廣泛。半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine proteinase inhibtor，CPI）是PI中的一類重要的蛋白酶抑制劑，在動(dòng)植物體內(nèi)廣泛存在，能夠參與生命體內(nèi)的多種生理生化反應(yīng)，與巰基蛋白水解酶形成動(dòng)態(tài)平衡。CPI參與調(diào)節(jié)各種生命活動(dòng)，在植物的種子萌發(fā)、胚體發(fā)育、組織分化、細(xì)胞程序性死亡、防治蟲(chóng)害、果實(shí)成熟等方面具有重要的作用。此外，近年來(lái)有研究也發(fā)現(xiàn)CPI在植物抗逆脅迫方面也發(fā)揮了重要的作用，如，擬南芥中存在的兩種半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）基因AtCYSa和AtCYSh在逆境環(huán)境下，如低溫、干旱、鹽、氧化脅迫下可以被誘導(dǎo)表達(dá)，且在酵母中過(guò)表達(dá)能提升酵母在脅迫環(huán)境下抗低溫、鹽、干旱、氧化脅迫能力。麻風(fēng)樹(shù)的JcCPI基因在大腸桿菌和煙草中進(jìn)行異源過(guò)表達(dá)也可以提升其耐鹽能力，而且轉(zhuǎn)基因煙草中丙二醛含量更低，抗過(guò)氧化酶活力更高，這表明CPI可以通過(guò)影響過(guò)氧化物酶活性來(lái)降低非生物脅迫引起的次生氧化脅迫，最終提高植物對(duì)非生物脅迫的抗性和適應(yīng)能力。目前，已經(jīng)從擬南芥、玉米、番茄、麻風(fēng)樹(shù)、小麥等50多種植物中克隆得到了CPI基因，研究發(fā)現(xiàn)CPI蛋白在植物種子中的含量較多，CPI蛋白的序列保守性也非常強(qiáng)，而甘薯中的CPI蛋白目前尚未有相關(guān)報(bào)道。本研究采用RT-PCR從甘薯嫩葉組織中克隆得到CPI基因，構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21對(duì)其抗逆能力進(jìn)行了初步探索，使用多種生物信息學(xué)軟件對(duì)其進(jìn)行了分析，為未來(lái)深入研究甘薯CPI基因的功能打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在自然條件下從大田中采集徐薯18的根、莖、葉等組織，采集后即清洗擦干，短期凍存在液氮中。克隆宿主菌株：大腸桿菌DH5ɑ，表達(dá)菌株大腸桿菌BL21，原核表達(dá)載體是pET-32a(+)。

1.1.1 主要工具酶與試劑 RNA提取所用Trizol及M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Invitrogen 公司，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶KOD-FX-Neo 酶購(gòu)東洋紡公司，T4 DNA連接酶購(gòu)自TAKARA公司，引物及測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與RT-PCR 以徐薯18（四川省農(nóng)科院生核所提供）各種組織為材料，液氮冷凍后用研缽磨碎成粉末后立刻使用Trizol進(jìn)行總RNA提取，提取得到的RNA進(jìn)行等比例混勻，總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后取1μg RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所有方法均按照Invitrogen 公司試劑盒的推薦方法完成。

1.2.2 甘薯CPI基因克隆及載體構(gòu)建 以反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈cDNA為模板，IbCPI-F：5'-CG GGATCCATGGCTTTGGGAGGCGTTAC-3'和IbCPI-R：5'-CCCAAGCTTTTAAACACTGA CACTAGAGATGCCA-3'為引物，使用KODPlus-Neo（1 U/μL）高保真酶進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2分鐘，98℃變性10秒，56℃退火5秒，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸8分鐘。PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，純化后的PCR產(chǎn)物及pET-32a(+)載體分別使用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后使用T4DNA連接酶在16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑選4個(gè)陽(yáng)性克隆并送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的菌株提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 序列分析 根據(jù)甘薯CPI基因測(cè)序結(jié)果，使用BLAST和DNAman軟件進(jìn)行基因及蛋白序列同源比對(duì)，利用ProtParam分析IbCPI蛋白的理化性質(zhì)包括：相對(duì)分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)(pI)、半衰期、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等，使用NPS@和Swiss-model進(jìn)行IbCPI蛋白的二級(jí)和三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)分析，利用TMpred、Wolf psort、NetPhos 3.1、SignalP 4.1 Server等軟件分別進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、磷酸化位點(diǎn)和信號(hào)肽等分析，使用MEGA5.0對(duì)其他10個(gè)物種的CPI蛋白與甘薯CPI蛋白進(jìn)行聚類分析，將甘薯CPI蛋白提交至STRING分析能與甘薯CPI蛋白發(fā)生互作的潛在蛋白。

1.2.4 重組菌株的脅迫處理 將重組菌和對(duì)照菌株（空載體）分別置于2mL LB（含有50μg/mL Amp）液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，將其接入10mL液體LB中當(dāng)OD600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。取此培養(yǎng)液分別移入含有Amp的LB培養(yǎng)基和30%PEG6000的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩培養(yǎng)，分別進(jìn)行無(wú)脅迫培養(yǎng)和干旱脅迫；另取培養(yǎng)液接入含有Amp的LB培養(yǎng)基中放置于45℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，對(duì)重組菌株進(jìn)行高溫脅迫。對(duì)無(wú)脅迫培養(yǎng)每隔2小時(shí)進(jìn)行取樣及利用紫外分光光度儀測(cè)定OD600值，對(duì)脅迫培養(yǎng)每隔4h取樣并測(cè)定OD600值，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，最終繪制生長(zhǎng)曲線。

圖1 CPI基因PCR產(chǎn)物電泳圖M：DL5000 Maker；1：以甘薯CPI基因PCR產(chǎn)物Fig.1 Agarose electrophoresis analysis of IbCPI RT-PCR productsM：DL5000 Maker；lane 1： IbCPI gene PCR product of sweet potato

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建

以提取得到的徐薯18嫩葉總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)在350bp左右出現(xiàn)一明顯條帶，大小與預(yù)期片段大小基本一致，PCR產(chǎn)物膠回收后與pET-32a(+)載體分別進(jìn)行BamHI和HindIII雙酶切，使用DNA連接酶過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，挑取陽(yáng)性克隆PCR驗(yàn)證后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.2 IbCPI蛋白質(zhì)序列分析

測(cè)序結(jié)果顯示甘薯CPI基因長(zhǎng)度為345bp，其翻譯的蛋白長(zhǎng)度為114aa，使用Protparam軟件、對(duì)甘薯CPI蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，甘薯CPI蛋白分子式為C564H894N142O176S1，分子量為12.51 kDa，理論等電點(diǎn)4.83，不穩(wěn)定系數(shù)是30.59，因此是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，脂肪系數(shù)為89.74，親水性值為-0.302，因此甘薯CPI是一個(gè)親水性蛋白。通過(guò)BLAST軟件搜尋與IbCPI蛋白同源序列，甘薯CPI蛋白與Ipomoea nil、Ziziphus jujuba、Jatropha curcas、Sesamum indicum的CPI蛋白的序列相似度分別是86.96%、58.26%、55.65%、55.65%。C P I蛋白具有非常保守的活性位點(diǎn)區(qū)域，甘薯CPI蛋白也具有類似的保守序列，在其第48-52位氨基酸含有活性位點(diǎn)基序Q-X-V-XG(Q48-V49-V50-A51-G52)。

圖2 IbCPI與其他植物CPI全長(zhǎng)蛋白序列比對(duì)Fig.2 Alignment of IbCPI with cystatins from other plant speciesbased on the full-length amino acid sequence.

2.3 IbCPI蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

使用TMpred軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)甘薯CPI沒(méi)有明顯的跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)。SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘薯CPI蛋白可能沒(méi)有信號(hào)肽，因此可能是一種胞內(nèi)蛋白，亞細(xì)胞定位軟件Wolf psort對(duì)甘薯CPI蛋白在甘薯細(xì)胞內(nèi)的位置進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K最近鄰(k-Nearest Neighbor，KNN)值為14，其中8個(gè)位于細(xì)胞質(zhì)中，3個(gè)位于葉綠體中，3個(gè)位于胞外，即甘薯CPI定位可能性為：細(xì)胞質(zhì)＞葉綠體＞胞外。NetPhos 3.1分析結(jié)果表明甘薯CPI蛋白可能具有7個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中有2個(gè)Serine位點(diǎn)（Pos13、Pos18），1個(gè)Threonine位點(diǎn)（Pos7），3個(gè)Tyrosine位點(diǎn)（Pos8、Pos19、Pos23），這表明IbCPI可能可能受多種蛋白激酶的磷酸化和去磷酸化所調(diào)控， 參與各種細(xì)胞調(diào)控過(guò)程。

2.3.1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用NPS@軟件對(duì)IbCPI蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中α-螺旋有24個(gè)（21.05%）氨基酸，β-折疊有34個(gè)（29.82%）氨基酸，無(wú)規(guī)則卷曲有54個(gè)（47.37%）氨基酸，模糊狀態(tài)有2個(gè)（1.75%）氨基酸。利用 Swiss Model數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)了甘薯CPI蛋白的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)序列搜索得到最適模板4tx4.1.B（Cysteine proteinase inhibitor of Vigna unguiculata），其序列相似度為67.47%，可以作為模板進(jìn)行同源建模，得到甘薯CPI蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型（如圖3所示）。

圖3 IbCPI的三維結(jié)構(gòu)Fig.3Three-dimensional structure of IbCPI

2.3.2 蛋白互作分析 使用STRING蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，以Solanum lycopersicum的CPI蛋白為模板構(gòu)建甘薯CPI的蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，篩選最小相互作用分值為0.4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白可能與5個(gè)相關(guān)蛋白（TUB、F35H、ELF4、56B23-g6、Pro1）可以發(fā)生相互作用（如圖4所示），但是這些相互作用的具體調(diào)控模式目前尚不清楚。

圖4 甘薯CPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Protein-protein interaction analysis of IbCPI

2.4 進(jìn)化樹(shù)分析

進(jìn)化樹(shù)分析是使用MEGA5.0軟件的鄰接歸并法(Neighbor-Joining法)構(gòu)建，bootstrap 自檢重復(fù)1000次。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blast 軟件將甘薯CPI基因編碼的氨基酸序列與GenBank中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)和相似性搜索。結(jié)果表明，克隆得到的甘薯CPI蛋白與Ipomoea nil的CPI蛋白的親緣關(guān)系最近，這與甘薯的物種分類情況也較為一致。

圖5 甘薯CPI蛋白進(jìn)化樹(shù)分析Fig.5 Phylogenetic tree of IbCPI

2.5 重組菌對(duì)脅迫的耐受性研究

2.5.1 無(wú)脅迫生長(zhǎng) 由圖6可知，在無(wú)脅迫條件下，含有IbCPI基因的菌體與對(duì)照菌株（含有空載體）的生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，這表明過(guò)表達(dá)IbCPI基因?qū)Υ竽c桿菌的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。

2.5.2 干旱脅迫 使用30%PEG6000對(duì)大腸桿菌進(jìn)行干旱脅迫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖7）含有目的基因的重組菌株的遲滯期在20小時(shí)左右，而對(duì)照菌株則為32小時(shí)，而且相比對(duì)照菌株，重組菌株的生長(zhǎng)更具優(yōu)勢(shì)，過(guò)表達(dá)IbCPI有利于大腸桿菌菌株在干旱脅迫下生長(zhǎng)。

2.5.3 高溫脅迫 將重組菌株和對(duì)照菌株均在45℃進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，對(duì)其進(jìn)行高溫脅迫，由圖8可以看出，相比無(wú)脅迫對(duì)照菌株和重組菌株在高溫脅迫下生長(zhǎng)速度都明顯下降，但是含有甘薯CPI基因的菌株生長(zhǎng)效果明顯優(yōu)于對(duì)照菌株，這表明過(guò)表達(dá)甘薯CPI基因有助于提升大腸桿菌的耐高溫能力。

圖8 重組菌在45℃的LB培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curves of recombinant bacteria in LB medium at 45℃

3 討論

甘薯又名甜薯，旋花科植物，屬喜光的短日照作物，是世界第六大糧食作物，在我國(guó)為第四大糧食作物，淀粉含量高、產(chǎn)量高、應(yīng)用前景廣闊。隨著當(dāng)前自然環(huán)境的惡化，各種非生物脅迫如干旱、鹽、堿以及重金屬等環(huán)境壓力的增加日益影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，但甘薯表現(xiàn)出了其特有的抗逆特性，能夠一定程度上地抵御外界環(huán)境帶來(lái)的生存壓力。因此，對(duì)甘薯相關(guān)抗逆基因的研究，對(duì)作物的抗脅迫性質(zhì)能力的改善，以及對(duì)提高經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量有著重要的意義。植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑是重要的組織防御應(yīng)激蛋白，同時(shí)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)調(diào)節(jié)，在植物的抗逆脅迫中也起到了重要的作用。本研究通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆得到甘薯全長(zhǎng)CPI基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)IbCPI蛋白也具有保守的 Q-X-V-X-G(Q48-V49-V50-A51-G52)結(jié)構(gòu)，三級(jí)結(jié)構(gòu)與其他CPI蛋白類似都具有3個(gè)β-折疊和1個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)，IbCPI蛋白可能與TUB、F35H、ELF4、56B23-g6、Pro1等蛋白能夠發(fā)生作用，但是目前的作用機(jī)制尚不清楚。將IbCPI基因插入原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的過(guò)表達(dá)，在高溫和干旱脅迫下發(fā)現(xiàn)重組菌株比對(duì)照菌株具有更短的遲滯期且生長(zhǎng)效果更佳，這表明IbCPI基因可能具有提升細(xì)胞的抗逆脅迫的能力，這為未來(lái)深入研究IbCPI基因的功能及提升甘薯的產(chǎn)量具有一定的意義。