TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

張曉興，王家建

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，病死率占總癌癥死亡率的第四位，嚴(yán)重危害婦女的身心健康[1]。人乳頭瘤病毒感染被認(rèn)為是引起宮頸癌的主要原因之一[2]。近年來研究者們熱衷于研究基因多態(tài)性與宮頸癌易感性的研究[3]，以期從基因?qū)用娼忉寣m頸癌的發(fā)病機(jī)制。基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP-2）是基質(zhì)金屬蛋白（MMP）的天然特異性抑制因子，它能夠與相應(yīng)的基質(zhì)金屬蛋白酶結(jié)合來共同維持基質(zhì)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定與結(jié)構(gòu)完整性[4]，TIMP-2是機(jī)體內(nèi)主要的內(nèi)源性抑制劑。本研究采用病例-對(duì)照的研究方法，通過Mass ARRAY基因分型的方法檢測(cè) TIMP-2基因上的多態(tài)性位點(diǎn)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)方法分析其位點(diǎn)多態(tài)性與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年6月至2016年8月浙江省湖州市婦幼保健院婦產(chǎn)科收治的宮頸癌患者280例為病例組，入選條件：（1）所有患者均經(jīng)臨床診斷確診為宮頸癌患者；（2）未經(jīng)過放射治療和化學(xué)治療；（3）精神狀況良好；（4）研究對(duì)象之間無直接親屬關(guān)系。對(duì)照組為年齡、性別及種族匹配的同時(shí)期在本院檢驗(yàn)科進(jìn)行體檢的300例健康人群，入選條件：（1）既往無腫瘤病史、慢性疾病、嚴(yán)重代謝性疾病及內(nèi)分泌失調(diào)等；（2）精神狀況良好；（3）研究對(duì)象之間無直接親屬關(guān)系。本研究已獲得所有研究對(duì)象的知情同意，符合倫理學(xué)的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2 試劑與儀器 全血基因組純化試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher公司），iPLEX Gold試劑盒（美國(guó)Sequenom公司）；MassARRAY質(zhì)譜儀（美國(guó)Sequenom公司），GeneAmp9700 PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.3 血樣采集及DNA提取 采集每位研究對(duì)象外周靜脈血5ml，置于EDTA抗凝管中，現(xiàn)場(chǎng)編號(hào)并登記姓名，所有標(biāo)本采集當(dāng)天送回實(shí)驗(yàn)室，置于―70℃冰箱保存，以備DNA提取。采用全血DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4 基因分型 從NCBI和HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢TIMP-2基因的多態(tài)性位點(diǎn)，選擇在CHB人群最小等位基因頻率≥5%的位點(diǎn)，最終確定了TIMP-2基因上的TIMP-2-418G/C和TIMP-2+853G/Al兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)作為本研究中的研究位點(diǎn)。選擇單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，采用Sequenom MassARRAY SNP基因分型技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分型。單堿基延伸引物委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成。反應(yīng)在MassArray質(zhì)譜儀中進(jìn)行，基因分型使用Sequenom MassARRAY RS1000軟件進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用 SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用精確檢驗(yàn)對(duì)對(duì)照組進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡（HWE）檢驗(yàn)，評(píng)估對(duì)照組的可靠性。計(jì)算各位點(diǎn)的等位基因及基因型頻數(shù)，采用2檢驗(yàn)比較兩組間各位點(diǎn)的等位基因頻率分布差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步確定檢測(cè)的位點(diǎn)是否與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。應(yīng)用 SNP Stats在線軟件（http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm）測(cè)定各個(gè) SNP位點(diǎn)基因型與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)。以相對(duì)優(yōu)勢(shì)比（）和95%可信區(qū)間（）來評(píng)估SNP與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果TIMP-2-418G/C和TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布如表1和表2所示。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)病例組和對(duì)照組人群的基因型頻率分布均符合該定律（＞0.05），說明選擇的樣本具有代表性。

2.2 TIMP-2基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布 TIMP-2-418G/C多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），而基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2＝12.028=0.002）；TIMP2+853A/G 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均＜0.01），且病例組等位基因G頻率分布明顯高于對(duì)照組。見表1～2。

2.3 TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析 在等位基因模型下，TIMP-2-418G/C多態(tài)性與宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)均不存在相關(guān)性（均＞0.05）；等位基因模型下，TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點(diǎn)的G等位基因與宮頸癌存在相關(guān)性（＜0.05），C等位基因與宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)不存在相關(guān)性（＞ 0.05）。見表3。

2.4 TIMP-2基因多態(tài)性位點(diǎn)在不同遺傳模型下與宮頸癌的相關(guān)性分析 通過無條件邏輯回歸模型，引入三種遺傳模型（顯性、隱性和加性），分別計(jì)算各位點(diǎn)等位基因的和95%，衡量各位點(diǎn)風(fēng)險(xiǎn)等位基因?qū)m頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的效應(yīng)大小，并按照性別、年齡修正。結(jié)果顯示在顯性模型下，TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點(diǎn)的最小等位基因G與增加宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性（=0.045）；TIMP-2－418G/C多態(tài)性位點(diǎn)在三種遺傳模型下都與宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)（＞0.05）。見表4。

3 討論

表1 TIMP-2基因-418位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布 例（%）

表2 TIMP-2基因+853位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布 例（%）

表3 TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián) 例（%）

本研究通過病例-對(duì)照的研究設(shè)計(jì)，利用Mass ARRAY技術(shù)檢測(cè)TIMP-2基因的TIMP-2-418G/C與TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點(diǎn)，并分析該基因的多態(tài)性位點(diǎn)與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示：TIMP2+853A/G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布在病例組和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，病例組等位基因G頻率分布明顯高于對(duì)照組，顯著增加宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)（=0.045）。通過各位點(diǎn)的基因型頻率比較發(fā)現(xiàn)TIMP-2+853G/A多態(tài)性位點(diǎn)的G/G基因型頻率在病例和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，能顯著增加宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)（=0.035）。此外，研究中沒有發(fā)現(xiàn)TIMP-2-418G/C多態(tài)性位點(diǎn)與宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性（＞ 0.05）。

TIMPs（TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4）是MMPs主要的天然內(nèi)源性抑制劑，TIMP-2可以抑制任意一種MMPs特異性結(jié)合，是一種相對(duì)分子量為21kd的非糖基化蛋白,含有192個(gè)氨基酸[5]。近年來，許多關(guān)于基因調(diào)控的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了MMPs與TIMPs比例失衡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起重要作用[6]。有研究表明 TIMP2分子在宮頸癌組織中的表達(dá)與組織分化程度和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。本研究結(jié)果顯示TIMP2+853A/G多態(tài)性位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在病例組和對(duì)照組的分布具有顯著性差異，能顯著增加宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)（=2.35，95%1.24～ 3.15=0.035）。

綜上所述，本研究結(jié)果表明TIMP-2基因多態(tài)性與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)之間存在相關(guān)性，表明TIMP-2基因多態(tài)性在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中可能起著重要的作用。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了TIMP-2基因上與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)，但本研究樣本量相對(duì)較少。因此，在后續(xù)的研究中我們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步在大量人群中去驗(yàn)證這些多態(tài)性位點(diǎn)及其與宮頸癌患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性；而且沒有進(jìn)行候選SNP位點(diǎn)的功能學(xué)研究，所以在后續(xù)的研究中還需用功能實(shí)驗(yàn)證候選基因與宮頸癌的相關(guān)性；最后，也需要在不同的人群中去驗(yàn)證這些多態(tài)性位點(diǎn)，以期為宮頸癌的臨床診斷及治療提供依據(jù)。

表4 各個(gè)遺傳模型下候選SNP對(duì)宮頸癌患病的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)