miR-203表達(dá)異常與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系

戴磊，吳賢江，張舟徑，李健君

甲狀腺癌的發(fā)病率近年來逐步上升，已成為最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤[1]。新病例在全世界范圍內(nèi)幾乎為300000例，平均年齡為50歲，每年有近40000人死亡[2]。而甲狀腺乳頭狀癌（PTC）正是所有甲狀腺惡性腫瘤中最常見的病理分型，其發(fā)病率也在逐年上升[2]。進(jìn)一步了解甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生及發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制有助于進(jìn)一步提高患者的生存率，并為一些中晚期的特殊患者提供新的治療方案。miRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們?cè)趧?dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，從而進(jìn)一步調(diào)控某些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)[3]。該類分子在人類惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中也起到了重要的生物學(xué)作用，目前已知的與甲狀腺乳頭狀癌密切相關(guān)的 miRNA有：miR-146b，miR-222，miR-221和miR-151；而miR-222，miR-221與甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的遷徙性更有著密切的關(guān)系[4-5]。而外周循環(huán)血中miR-222和miR-146b的水平被報(bào)道與甲狀腺乳頭狀癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究表明miR-203在胃癌、直結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌、子宮內(nèi)膜癌及皮膚黑色素瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中均起到了關(guān)鍵的作用[6-9]。而miR-203與甲狀腺乳頭狀癌之間的關(guān)系并沒完善的研究進(jìn)行報(bào)道。本研究通過實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-203在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)情況及目標(biāo)基因進(jìn)行了驗(yàn)證，進(jìn)一步闡述了miR-203生物學(xué)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集寧波市第二醫(yī)院甲狀腺外科2016年3月到2017年3月行甲狀腺手術(shù)患者病理標(biāo)本70例，其中甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本40例，甲狀腺良性腫瘤標(biāo)本30例。新鮮標(biāo)本均在手術(shù)后立即于液氮存放，所有甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本均由細(xì)針穿刺、術(shù)中冰凍病理及術(shù)后常規(guī)石蠟標(biāo)本3次確認(rèn)。其中10例甲狀腺乳頭狀癌及10例匹配對(duì)照甲狀腺良性腫瘤組織用于基因芯片使用。人甲狀腺濾泡細(xì)胞細(xì)胞系為：Nthy-ori3-1；人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系包括：HTH83、NIM-1和TPC-1，上述四株細(xì)胞系均購買于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，用10%胎牛血清（HyClone、Logan，USA）及 100 U/ml青霉素的 DMEM（Gibco、Carlsbad，USA）培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃的含5%CO2的濕潤空氣。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞增殖 細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h接種于96孔板，5 000細(xì)胞/孔。接種48 h后CCK8試劑盒（Dojindo、Kumamoto、Japan）計(jì)數(shù)，450nm吸光度由全自動(dòng)酶標(biāo)儀（SpectraMax190，USA）測量。

1.2.2 細(xì)胞侵襲 接種1×104培養(yǎng)細(xì)胞于用Matrigel（BDBiosciences）覆膜的Tranwells上腔室，待Matrigel干燥后，抽去上層的DMEM，用500lPBS沖洗凝膠。培育24 h后將未透膜的細(xì)胞小心擦除，甲醇固定后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚染色，每膜用熒光倒置顯微鏡隨機(jī)取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)。

1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄熒光 PCR 細(xì)胞及組織總RNA使用Trizol（LifeTechnologies，USA）按照說明書提取并于－80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨aqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成總cDNA后由特異性引物按照SYBR Green（Finzyme）試劑盒要求行熒光PCR檢測，定量計(jì)算內(nèi)參選擇為：mRNA參照GAPDH；miRNA參照miR-16。

1.2.4 Western blot檢測 細(xì)胞及組織總蛋白由RIPA（Thermal）及蛋白酶（Sigma-Aldrich）預(yù)混液制備，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜（RocheDiagnostics，Switzerland）。5%脫脂牛奶阻斷后，轉(zhuǎn)膜由特定抗體孵育過夜。

1.2.5 熒光素酶檢測 將用熒光素標(biāo)記酶標(biāo)記3’-UTR（野生和變異型survivin）的HEK 293T細(xì)胞接種于24孔板，加入10ngpRL-TK和20pmolmiRNA模擬品。用雙熒光素酶報(bào)告試劑盒（Promega、Madison，USA）在轉(zhuǎn)染后48 h檢測熒光量。

2 結(jié)果

2.1 miR-203在甲狀腺乳頭狀癌及癌細(xì)胞系中表達(dá)miR-203在甲狀腺乳頭狀癌及3株甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系中表達(dá)較正常甲狀腺組織表達(dá)明顯下降（封二彩圖1）。

2.2 細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-203與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系 CCK8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)均證明在轉(zhuǎn)染miR-203模擬品組對(duì)比miR-NC組中腫瘤細(xì)胞的活性被明顯抑制，而凋亡水平明顯上升（封二彩圖2）。Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-203對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲力的影響，轉(zhuǎn)染miR-203 TPC-1細(xì)胞惡性程度和侵襲力均明顯下降。

2.3 miR-203和目標(biāo)基因survivin之間的關(guān)系 在甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本及乳頭狀癌細(xì)胞系中 survivin mRNA及蛋白的表達(dá)量均有所上升（封二彩圖3）。分別在TPC-1細(xì)胞中建立了野生型和突變型survivin3′UTR的熒光素酶檢測系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)miR-203能成功阻斷含野生型survivin3′UTR的熒光素酶而對(duì)突變型無效（封二彩圖3C）；同時(shí)轉(zhuǎn)染miR-203 siRNA阻斷miR-203的TPC-1細(xì)胞中survivin的表達(dá)量明顯上升（封二彩圖3D、E）。

2.4 miR-203啟動(dòng)子區(qū)乙酰化與miR-203表達(dá)的關(guān)系 經(jīng)TSA處理的TPC-1細(xì)胞miR-203表達(dá)量顯著增加并隨TSA劑量的增加而增加（圖1）。

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌（PTC）是目前臨床上最常見的甲狀腺惡性腫瘤，早期沒有特異的臨床表現(xiàn)，這使該疾病的早期診斷變得困難重重[10]。大多數(shù)患者預(yù)后良好，10年生存率約為90%。然而，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生率卻高達(dá)20～50%[2]，而PTC患者接受全甲狀腺切除術(shù)的區(qū)域復(fù)發(fā)率為5～20%[4]。目前常用的治療手段有手術(shù)治療、內(nèi)放射治療及內(nèi)分泌抑制治療，在非遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中治療后的5年生存率超過95%。但是仍有部分患者有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部淋巴結(jié)的復(fù)發(fā)，而這一情況在某些特殊的甲狀腺乳頭狀癌病理分型中尤其明顯，而有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)的患者的5年生存率則降至59%[11]。

圖1 阻斷啟動(dòng)子區(qū)乙酰化導(dǎo)致miR-203表達(dá)量上升

miRNAs是一類非編碼短RNA，在細(xì)胞活動(dòng)的周期里起到重要的調(diào)節(jié)作用，在多種惡性腫瘤包括甲狀腺癌中miRNA也起到了重要的作用[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)miRNAs通過調(diào)制腫瘤形成發(fā)生的途徑從而在致癌和腫瘤抑制中的作用。此外，幾個(gè)miRNAs被報(bào)道與腫瘤的增殖、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)[12]。miR-146b[13]，miR-222[14]及 miR-20b[15]均被研究者證明在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展過程中能起到促進(jìn)或是抑制的作用。但同時(shí)更多的miRNA的生物學(xué)作用和分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

有報(bào)道稱miR-203在皮膚黑色素瘤[8]及非小細(xì)胞肺癌[12]均低表達(dá)，這提示miR-203可能在更多的惡性腫瘤中起到關(guān)鍵作用。本研究通過Affymetrix芯片發(fā)現(xiàn)miR-203在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)也被抑制，但其生物學(xué)作用及分子學(xué)機(jī)制未被詳細(xì)報(bào)道。因此繼續(xù)通過靶基因預(yù)測軟件預(yù)測了survivin可能是miR-203的上游調(diào)節(jié)基因。相關(guān)報(bào)道描述 survivin在甲狀腺乳頭狀癌及局部轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)標(biāo)本中均有很高表達(dá)[16]，考慮survivin與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后判斷均有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)miR-203表達(dá)情況與survivin表達(dá)呈現(xiàn)相反變化趨勢，進(jìn)一步完善了survivin與甲狀腺乳頭狀癌之間關(guān)系的研究。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)乙酰化是造成miR-203表達(dá)降低的重要的機(jī)制。

通過本研究，筆者總結(jié)如下：（1）PTC組織中miR-203表達(dá)較正常組織明顯減少；（2）阻斷miR-203的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系細(xì)胞中survivin過表達(dá)；（3）阻斷乙酰化可使腫瘤細(xì)胞內(nèi)低表達(dá)的miR-203表達(dá)量恢復(fù)正常。以上結(jié)論均說明miR-203在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生過程中起到重要作用，而作為可檢測的小分子，miR-203極有可能成為甲狀腺乳頭狀癌的診斷或預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物；同時(shí)作為可被調(diào)控的生物靶點(diǎn)，miR-203也可作為今后靶向治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。