慢性鉛暴露對大鼠腦組織PARP1基因mRNA表達影響及與氧化應激的關系

李煒娟 楊天富 宛 明 徐群英 任清風 張中偉 馮建高 肖元梅

(南昌大學撫州醫學院，江西 撫州 344000)

鉛是一種能夠造成多器官損害的重金屬毒物，與其他器官系統相比較，神經系統損傷最敏感，尤其是正在生長發育中的大腦〔1〕。氧化應激損傷被認為是鉛致神經系統損傷的可能機制之一。氧化應激是指機體在一些有害因素的作用下，體內氧化與抗氧化系統失衡，自由基在體內大量堆積，引起DNA、蛋白質、脂質等大分子物質氧化損傷。在DNA氧化損傷修復過程中，腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)1作為DNA損傷的分子感受器，在氧化應激誘導DNA損傷時被激活，活化的PARP1介導堿基切除修復復合物參與受損DNA修復〔2,3〕。本研究主要分析慢性鉛暴露后大鼠大腦皮質、小腦、海馬組織中X線修復交叉互補基因(XRCC)1基因mRNA表達水平變化及其與腦組織鉛含量和氧化應激指標之間的關系。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 三水合乙酸鉛購于西隴化工廠(分析純)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒購于上海索萊寶生物科技公司；引物由Invitrogen公司合成；反式DNA標記購于全式金公司；Gill green核酸電泳檢測專用染料購于北京華越洋生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒購于美國Thermo公司；凝膠成像分析系統購于美國Synoptics公司；PCR擴增儀購于美國 BIO-RAD；6×加樣緩沖液購于全式金公司；瓊脂糖購于BIOWEST AGAROSE 西班牙；多功能酶標儀購于美國 Molecular Devices；鉛標準溶液購于國家標準物質研究中心；AA-6300C型石墨爐原子吸收分光光度計購于日本島津公司；AAS SOLAAR M6石墨爐原子吸收分光光度計購于Thermo公司；722可見分光光度計購于上海精密科學儀器公司；低溫高速離心機購于德國 Hettich。

1.2實驗動物分組及處理 40只剛斷乳SPF級健康、雄性SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司〔動物合格證號：SCXK(京)2012-0001〕，體重90～100 g，適應性喂養1 w后，根據體重按隨機分組法分為對照組和4個暴露組，每組8只，分別自由飲用去離子水(對照組)、100 mg/L乙酸鉛溶液(最低劑量組)、200 mg/L乙酸鉛溶液(低劑量組)、400 mg/L乙酸鉛溶液(中劑量組)、800 mg/L乙酸鉛溶液(高劑量組)，動物染毒和處理方法參照李煒娟等〔2〕的方法。

1.3檢測指標及方法 ①RT-PCR檢測PARP1基因mRNA表達：提取大鼠腦組織RNA；檢測RNA純度濃度后進行逆轉錄反應；進行聚合酶鏈式擴增反應；制備100 ml 2.0%瓊脂糖凝膠；制備膠板；加樣；電泳；凝膠成像系統觀察電泳結果〔4〕；②腦組織經消化后測定鉛含量〔5〕；③SOD、MDA、GSH-PX測定參照肖元梅等〔6～8〕的方法。

1.4統計學分析 應用SPSS18.0軟件進行單因素方差分析,進一步兩兩比較用最小極差法(LSD-t)法，相關分析用Pearson分析。

2 結 果

2.1各組大腦皮質、小腦、海馬中PARP1基因mRNA表達情況比較 最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠大腦皮質、小腦和海馬中PARP1基因mRNA表達量均顯著低于對照組(均P<0.05)，大腦皮質、小腦和海馬4個染鉛劑量組兩兩比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組腦組織中PARP1基因mRNA的表達水平

與對照組相比：1)P<0.05

M：DNA marker；1～5泳道依次為：對照組、最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組圖1 各組大腦皮質、小腦和海馬中PARP1基因mRNA的表達

2.2各組腦組織中鉛含量的變化 最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組大腦皮質、小腦、海馬中鉛含量均顯著高于對照組(均P<0.05)，低劑量組大腦皮質及海馬中鉛含量，中、高劑量組大腦皮質、小腦、海馬中鉛含量均顯著高于最低劑量組(均P<0.05)；中劑量組大腦皮質、海馬及高劑量組大腦皮質、小腦、海馬中鉛含量均顯著高于低劑量組(均P<0.05)；高劑量組大腦皮質及海馬中鉛含量顯著高于中劑量組(均P<0.05)。見表2。

表2 各組腦組織中鉛含量比較

與對照組比較：1)P<0.05；與最低劑量組比較：2)P<0.05；與低劑量組比較：3)P<0.05；與中劑量組比較：4)P<0.05；下表同

2.3各組腦組織SOD、MDA和GSH-PX水平比較 最低劑量組大腦皮質及小腦SOD、GSH-PX含量，低劑量組大腦皮質及小腦SOD、GSH-PX含量、海馬SOD含量，中、高劑量組大腦皮質、小腦、海馬中SOD、GSH-PX含量均顯著高于對照組(均P<0.05)；最低劑量組海馬MDA ，低劑量組小腦及海馬MDA，中、高劑量組大腦皮質、小腦、海馬MDA含量均顯著高于對照組(均P<0.05)。并隨著染鉛劑量的升高，各腦組織SOD、GSH-PX含量基本呈逐漸下降趨勢而MDA水平基本呈逐漸升高趨勢，但只有中、高劑量組大腦皮質、小腦、海馬SOD含量，低、中、高劑量組小腦MDA，高劑量組大腦皮質MDA較最低劑量組差異有統計學意義(均P<0.05)；高劑量組大腦皮質SOD、小腦SOD及MDA、海馬SOD 含量較低劑量組差異有統計學意義(均P<0.05)；高劑量組小腦MDA含量較中劑量組差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4PARP1 mRNA表達量與腦組織鉛含量和氧化應激指標相關性 大腦皮質、小腦和海馬PARP1 mRNA表達量均與其組織鉛含量及MDA含量呈顯著負相關(P<0.05，P<0.01)，與SOD含量呈顯著正相關(P<0.05)，大腦皮質及小腦PARP1 mRNA表達量與GSH-PX含量呈顯著正相關(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表3 各組腦組織SOD、MDA、GSH-PX水平比較

表4 PARP1 mRNA表達量與腦組織鉛含量和氧化應激指標的相關性

1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

PARP1活化方式有2種：①N末端鋅指結構與DNA斷裂處結合活化PARP1；②第3鋅指結構通過增強C末端催化區域活性使PARP1構象發生改變，進而活化PARP1〔9～11〕。DNA單鏈斷裂時，PARP1識別有缺口的DNA并與之結合被激活，活化的PARP1與DNA損傷處結合形成同型二聚體，催化底物煙酰胺腺嘌呤核苷酸(NAD+)轉化為二磷酸腺苷(ADP)核糖基化蛋白受體，后者與核受體蛋白結合形成帶有大量負電荷的多聚ADP核糖鏈，多聚ADP核糖鏈達到一定長度后降解產生聚ADP核糖，聚ADP核糖介導堿基切除修復復合物(XRCC1作為腳手架，與聚合酶β、DNA連接酶Ⅲ結合形成的復合物〔12〕)參與DNA單鏈斷裂處的修復〔13〕，而過度的PARP1活化由于含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)依賴性和非依賴性細胞凋亡、NAD+和三磷酸腺苷(ATP)能量耗竭、Ca2+/Mg2+依賴性核酸內切酶活性增高和炎性介質過度表達等原因導致細胞死亡。因此，輕度的PARP1活化有利于細胞存活，而過度的PARP1活化則導致細胞死亡。

研究顯示，輕中度氧化應激誘導DNA損傷時，PARP1 mRNA表達增加，才能使細胞存活；嚴重氧化應激誘導DNA損傷時，PARP1 mRNA表達下降有利于神經細胞存活〔14〕。陳瑞〔15〕研究表明，JWA表達正常的細胞中，氧化應激誘導PARP1 mRNA表達明顯下降，同時XRCC1與PARP1之間存在著一種特殊的聯系(即XRCC1負調控PARP1的表達)。研究顯示，氧化應激損傷時，PARP1 mRNA表達量下降，PARP1 mRNA的低表達與癌變密切相關〔16〕。本研究表明慢性鉛暴露后大鼠腦組織PARP1 mRNA表達量與氧化應激損傷密切相關。慢性鉛暴露使大鼠大腦皮質、小腦、海馬PARP1 mRNA表達量下降，且與組織鉛含量負相關，說明鉛可通過誘導細胞氧化應激損傷而影響PARP1 mRNA表達。