Cx43、Shh與P-Ezrin蛋白在胃癌組織中的表達及意義

潘理會 霍 峰 李春輝

(承德醫學院生物工程研究室，河北 承德 067000)

胃癌的發生、發展因素眾多、步驟復雜，并涉及多方面機制。迄今為止，關于胃癌的發病機制尚不清楚。有研究發現胃癌的發生機制可能與間隙連接-43(Cx43)、Hedgehog通路與活化的細胞骨架連接蛋白(P-Ezrin)相關，本實驗通過比較Cx43、Shh與P-Ezrin蛋白在正常胃黏膜與胃癌組織中的表達來分析三者與胃癌臨床病理特征間的關系及Cx43、Shh與P-Ezrin之間的相互關系。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集承德醫學院附屬醫院2014年3月至2015年10月手術切除經病理證實的胃癌組織標本120例，患者術前均未接受放化療，正常胃組織(距離腫瘤10 cm以上視為正常胃組織作為對照)50例。120例胃癌患者中，男73例，女47例，年齡29～85〔平均(55.01±10.4)〕歲；>55歲64例，≤55歲56例；高中分化者52例，低分化者68例；無淋巴結轉移者50例，有淋巴結轉移者70例；未侵及漿膜層者50例，侵及漿膜層者70例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期67例。

1.2主要試劑和儀器 免疫組織化學試劑鼠抗人Cx43、Shh及P-Ezrin 抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，Western印跡所用試劑兔抗人一抗Cx43、Shh及P-Ezrin 抗體購自Bioword Technology公司，RIPA組織裂解液(BB120031)購自上海貝博公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗及電化學發光(ECL)超敏發光液均購自北京索萊寶科技有限公司，免疫組織化學所需儀器全自動免疫組化染色機(美國VENTANA，Roche公司)，Western印跡所用儀器紫外分光光度儀(DU800 美國貝克曼公司)，酶標儀MK3(Thermo labsystems公司)。

1.3免疫組織化學法 正常胃組織與胃癌組織常規石蠟包埋，連續切片4 μm貼附于經多聚賴氨酸處理的玻片上，80℃烘烤50 min，將切片放入免疫組織化學染色機按正常程序運行，用磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗(其余染色步驟相同)作為陰性對照，用已知正常胃組織的陽性切片作為陽性對照。光鏡下觀察切片中Cx43、Shh及Ezrin蛋白的表達和分布情況，每張切片選取5個高倍視野(×400)。Cx43蛋白陽性主要分布于細胞質或胞膜上，呈棕黃色顆粒。Shh蛋白陽性主要分布于細胞質，呈棕褐色顆粒。Ezrin蛋白陽性主要分布于細胞質內呈棕黃色顆粒分布。判斷標準同時考慮染色強度和陽性細胞百分率： Cx43、Shh按染色強度分級，無著色為0分，淡黃為1分，黃或深黃2分，褐或棕黃3分；陽性細胞計數<10%為0分，陽性細胞計數10%～25%為1分，陽性細胞計數26%～50%為2分，陽性細胞計數51%～75%為3分，陽性細胞計數≥76%為4分。兩者相加<2 分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中等強度陽性()，6～7分為強陽性()。Ezrin蛋白按染色強度分級，無著色為0分，黃或深黃為1 分，棕黃或褐色2 分，深褐色為3分；陽性細胞計數<15%為0分，陽性細胞計數16%～30%為1 分，陽性細胞計數31%～50%為2分，陽性細胞計數51%～70%為3分，陽性細胞計數≥71%為4分。兩者相加<2分為陰性(-)，2～3 分為弱陽性(+)，4～5分為中等強度陽性()，6～7 分為強陽性()。結果判定由兩名具備高級職稱的病理醫師經雙盲法獨立評分。

1.4Western印跡技術 取新鮮組織稱量后置于勻漿器內，加入裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)充分勻漿離心后提取組織蛋白。應用BCA法檢測蛋白濃度，并計算出蛋白上樣體積，加入上樣緩沖液后100 ℃水浴10 min。水浴的蛋白依次進行SDS-PAGE電泳(12%分離膠+5%濃縮膠)、轉膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗和顯影等步驟。顯影后膠片采用Quantity one圖像分析軟件對蛋白電泳條帶灰度值進行定量分析，按照下列公式計算：蛋白相對定量=目的蛋白灰度值/同標本GAPDH內參灰度值。

1.5統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件行t及秩和檢驗。

2 結 果

2.1免疫組織化學Cx43、Shh及P-Ezrin在胃癌組織和正常組織中的表達 Cx43、Shh及P-Ezrin陽性表達主要位于細胞質，Cx43正常胃組織中呈強陽性表達，在高-中分化胃癌組織中呈陽性表達，在低分化胃癌組織中呈弱陽性表達；Shh及P-Ezrin在正常胃組織中呈陰性表達，在高-中分化胃癌組織中呈陽性表達，在低分化胃癌組織中呈強陽性表達，見圖1。

2.2Western印跡法對胃癌組織和正常組織中的Cx43、Shh及P-Ezrin進行蛋白定量分析 正常胃組織Cx43蛋白的相對含量(0.93±0.09)明顯高于胃癌組織Cx43蛋白的相對含量(0.11±0.05)，正常胃組織Shh(0.24±0.02)和P-Ezrin(0.36±0.03)中蛋白的相對含量明顯低于胃癌組織(1.17±0.31，2.18±0.54，P<0.05)；Cx43、Shh及P-Ezrin的表達與胃癌的分化程度有無淋巴結轉移、胃癌的浸潤深度(侵及漿膜層)、TNM分期有關(P<0.05)，與患者的性別和年齡無關(P>0.05)，見圖2、表1。

圖1 Cx43、Shh及P-Ezrin在胃癌組織和正常組織中的表達(IHC，×200)

臨床病理特征nCx43 P值Shh P值P-EzrinP值年齡 >55歲640.27±0.030.4731.23±0.120.4851.74±0.180.187 ≤55歲560.34±0.031.07±0.112.07±0.21性別 男性731.53±0.640.3430.97±0.100.2811.87±0.190.218 女性471.86±0.821.38±0.142.01±0.20分化程度 高-中分化520.41±0.040.0010.7±0.070.0040.90±0.090.000 低分化 680.07±0.011.62±0.163.31±0.32TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期530.43±0.040.0030.74±0.070.0100.85±0.090.007 Ⅲ+Ⅳ期670.06±0.011.67±0.173.47±0.35侵及漿膜 是700.39±0.030.0070.77±0.080.0160.90±0.090.011 否500.07±0.011.58±0.163.33±0.33淋巴結轉移 是700.38±0.040.0000.72±0.070.0010.97±0.100.003 否500.07±0.011.66±0.173.29±0.33

1.正常胃組織；2.高-中分化胃癌組織；3.低分化胃癌組織圖2 正常胃組織和胃癌組織中Cx43,Shh及P-Ezrin蛋白Western印跡電泳

2.3Cx43與Shh，P-Ezrin蛋白在胃癌中表達的相關性 胃癌中：Cx43與Shh表達呈負相關(r=-0.733，P=0.000)；Cx43與P-Ezrin呈負相關(r=-0.896，P=0.000);Shh與P-Ezrin蛋白呈正相關(r=0.911，P=0.000)。

3 討 論

Cx43蛋白作為縫隙連接通道的組成部分，在細胞間存在信息交流，發揮細胞間接觸抑制的作用，正常細胞及癌旁細胞中均陽性表達。相反，在腫瘤細胞接觸抑制的作用常常消失〔1〕，而在癌細胞中最重要的就是細胞間接觸抑制消失，導致了Cx43在癌組織中表達明顯下降。Li等〔2〕研究結果顯示正常胃黏膜中Cx43蛋白的表達量明顯比胃癌組織高，而且在正常胃黏膜中完全表達。Tang等〔3〕研究發現胃腫瘤細胞與鄰近正常上皮細胞相比，Cx43蛋白呈顯著低表達；淋巴結轉移陽性的腫瘤細胞與胃原發的腫瘤細胞相比，Cx43蛋白亦呈顯著高表達，進而提出Cx43的低表達可能有助于胃癌的發生。本研究結果表明Cx43參與了胃癌轉移的過程，所以Cx43有可能成為胃癌預后的一個指標及胃癌治療的新的作用靶點。

在哺乳動物中，目前已確定了三個Hh家族成員Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog(Dhh)，分別編碼為具有自我催化能力的Shh、Ihh和Dhh蛋白〔4〕。目前的研究主要集中于Shh信號通路,它對哺乳動物的神經系統、皮膚、乳腺及胃腸、前列腺等多器官的發育起重要作用。Yao等〔5〕研究證明Shh與皮膚基底細胞癌、小細胞肺癌、前列腺癌、口腔癌等的發生與發展均有密切關系，Alam等〔6〕發現在肺癌細胞系中均存在Shh的高水平表達。本實驗認為Shh蛋白是胃癌惡性度高、預后差的預測因子，提供了對胃癌預后的判斷，提示Shh是胃癌發生、發展的一個關鍵作用點，有可能成為胃癌的診斷標志物及一個新的目標靶點。活化的Ezrin(P-Ezrin)有可能介導胃癌的發生、發展，去磷酸化可能是其失活的機制，當磷酸化的Ezrin再去磷酸化后，就可能恢復原來狀態，使結合位點失活。Ezrin的失活與激活同樣重要，失活得以調控與特異膜表面部位結合的Ezrin數量。磷酸化與去磷酸化保持在平衡狀態以維持機體正常的生理功能。腫瘤最主要的死因是它引起的侵襲及轉移所表現復雜行為的結果，腫瘤細胞為了能夠成功轉移必須逃脫許多機體免疫防御機制，因此，越來越多的研究證實，Ezrin在包括胃癌在內的多種腫瘤中存在高表達，且與腫瘤的發生、進展、侵襲、轉移密切相關〔7～12〕。Yu等〔13,14〕均報道Ezrin的表達在鼠橫紋肌肉瘤和骨肉瘤的轉移過程中發揮重要作用，抑制Ezrin蛋白的表達后，兩類細胞株的轉移能力大大降低，當Ezrin蛋白高度表達后可使原來無轉移特性的細胞獲得較高的轉移能力，顯示Ezrin蛋白是腫瘤轉移的關鍵因素，并且是預后差的指標。 本研究結果顯示，隨著胃癌惡性程度和臨床分期的增高，P-Ezrin的表達隨之增強，與Yu等〔13,14〕報道結果符合。

Cx43 磷酸化過程能夠影響 GJ 的通透性、電導率、門控特性等，從而對細胞間通訊產生各種作用，進而在體內外影響生理或者病理過程。本研究證實，Cx43與Shh和 P-Ezrin呈負反饋調節，Shh與P-Ezrin之間顯示正反饋的作用，提示Cx43可調節Hedgehog信號通路，使其在腫瘤細胞中具有調節細胞增殖與分化作用，并且正反饋調節 P-Ezrin基因和蛋白的表達，細胞間黏附減少，運動增加，細胞轉化、增殖，促進腫瘤細胞的生長和侵襲能力。