七氟烷對大鼠肺缺血再灌注損傷中ATM的影響

梁 燕 賈 珍 陳仲海 阿良德

(青海大學附屬醫院麻醉科，青海 西寧 810001)

肺缺血再灌注損傷(LIRI)可并發于多種外科手術中，譬如心肺轉流、肺移植等，是術后早期導致呼吸功能障礙及死亡的重要原因〔1〕。LIRI發生機制復雜，尚未完全闡明，目前認為機體產生大量的氧自由基在LIRI病程發展中起主要作用。七氟烷(Sev)作為應用于圍術期的麻醉藥，已證實其預處理和后處理對LIRI有保護作用，激活蛋白激酶(PK)C、核因子E2相關因子(Nrf)2、血紅素加氧酶(HO)-1信號通路，抑制自由基生成〔2，3〕，但其作用機制仍需深入研究。缺血再灌注(I/R)導致活性氧(ROS)上調，誘發DNA 損傷，在此過程中激活了自動磷酸化蛋白激酶(ATM)，并啟動下游多種信號通路，導致細胞凋亡和DNA修復。該進程穩定基因組，阻止錯誤的遺傳信息傳遞到子代當中。在其他類型研究中發現，ATM上調經PKC激活細胞核內Nrf2表達，從而啟動抗氧化反應元件(ARE)調控的基因轉錄，提高各種抗氧化酶的表達，例如HO-1和超氧化物歧化酶(SOD)等，清除自由基，減輕氧化損傷。本研究擬使用Sev后處理及ATM抑制劑KU-55933作用于LIRI老年大鼠模型，檢測ATM是否參與了Sev誘導的PKC和Nrf2表達提高。

1 材料與方法

1.1材料和儀器 清潔級Sprague Dawley(SD)成年大鼠，14周齡,450～500 g，雌雄各半，購自青海省實驗動物中心；KU-55933由上海源葉公司合成；Sev購自美國Sigma公司；丙二醛(MDA)、SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司；p-ATM、γ-H2AX、RKC、Nrf2、LaminA和GAPDH均購自美國Santa Cruz公司；二抗購自武漢博士德公司；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒購自碧云天；小動物呼吸機為上海奧爾科特生物科技公司產品。

1.2動物分組 50只SD大鼠隨機分為5組，①假手術組(Sham組)；②肺I/R組(I/R組)；③ATM抑制劑KU-55933組(KU組)為缺血前10 min，按照5 mg/kg通過靜脈注射KU-55933；④Sev組為缺血操作后吸入2%體積的Sev 10 min，再經10 min洗脫，然后再吸入2%體積Sev 10 min；⑤Sev后處理和KU-55933合并處理組(Sev/KU組)為缺血前靜脈注射KU-55933，缺血后兩次吸入Sev。大鼠手術完畢后即取肺部進行各項檢測。

1.3大鼠LIRI模型制作 SD大鼠按照0.1 mg·kg-1·min-1劑量腹腔注射戊巴比妥，麻醉后仰臥位固定，行氣管插管，接小動物呼吸機，按照10 ml/kg的100%氧氣(約呼吸70次/min)通氣量進行機械通氣，麻醉機同呼吸機進氣口相連。無菌條件下沿中線開胸，切開肌肉層和胸膜，暴露心臟和肺部，游離左肺門，缺血前于頸內靜脈三通處按照1 mg/kg劑量注射肝素，靜息5 min后，于呼吸末用無創血管夾從右上側至左下側夾閉左肺門(包括左主支氣管、左肺動、左肺靜脈)，阻斷45 min后松開血管夾進行血液和通氣再灌注，維持120 min，期間每隔1 h靜脈注射0.5 ml生理鹽水，用于維持體液平衡。再灌注結束后處死大鼠，留取標本，-80℃保存。Sham組不阻斷左肺門，持續灌注180 min；Sev兩次吸入和洗脫于再灌注期間進行；KU-55933注射于頸靜脈。

1.4肺濕/干重(W/D)比測量 取120 min再灌注左肺上半葉，稱重作為濕重(W)，再置于通風80℃恒溫箱中烤72 h至恒重，稱量作為干重(D)，計算W/D。

1.5血清MDA和SOD測量 取120 min再灌注后大鼠心臟動脈血，靜置后，離心分離，吸取上層血清，保存于-80℃，檢測時統一取出，按照試劑盒說明書，通過化學發光法，檢測血清MDA和SOD含量。

1.6免疫印跡檢測 Nrf2、LaminA檢測肺組織細胞核內水平，核蛋白提取按照試劑盒說明書進行；p-ATM、γ-H2AX、PKC和GAPDH檢測鼠肺組織內蛋白水平，肺組織勻漿后用裂解液聚氰基丙烯酸正丁酯裂解，10 000 r/min冰凍離心10 min，上清液用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法進行蛋白定量，取等量蛋白用聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳，并轉膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。PVDF膜經5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，用一抗4C過夜孵育，次日二抗室溫孵育2 h，然后用增強型化學發光檢測試劑進行顯色、定影，Epson1650Photo掃描儀收集圖像。

1.7統計學處理 采用SPSS21.0軟件行單因素方差分析、SNK-q檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1KU-55933阻礙了Sev降低LIRI大鼠肺W/D的保護作用 I/R組出現肺水腫，W/D比值(5.32±0.18)較Sham組(4.21±0.24)明顯增加(P<0.05)，證明LIRI模型建立成功，KU組W/D比值(5.36±0.31)無明顯變化，Sev組W/D比值(4.68±0.23)較I/R組明顯降低(P<0.05)，降低肺水腫，但Sev/KU組W/D比值(5.01±0.24)較Sev組明顯升高(P<0.05)。與Sham組比較，其他4組W/D值差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2MDA和SOD水平 同Sham組相比，I/R組SOD和MDA有明顯下降和升高，證明LIRI影響血清中SOD和MDA的表達，但同I/R組相比，KU組SOD有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)，對MDA沒有影響，Sev組較I/R組SOD活性顯著升高和MDA含量顯著下降，Sev/KU組SOD和MDA水平同Sev組差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3KU-55933抑制Sev上調的p-ATM和γ-H2AX LIRI導致肺組織中p-ATM和γ-H2AX表達上升，說明大鼠肺對I/R呈現應激性增加，而Sev應用有利于p-ATM和γ-H2AX的持續升高，證實p-ATM通路的啟動。但當預處理KU-55933時，p-ATM和γ-H2AX增加程度略有下降，經灰度掃描后，同Sev組相比，Sev/KU組p-ATM和γ-H2AX表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1和圖1。

2.4Sev上調PKC表達，KU-55933抑制上調的PKC 同Sham組相比，各組PKC均表達升高；同I/R組相比，Sev組中PKC明顯升高，而Sev/KU組明顯降低升高的PKC(P<0.05)。見表1和圖1。

2.5KU-55933部分抑制Sev上調的Nrf2 I/R組肺組織細胞核內Nrf2表達應激升高，經Sev處理后，肺組織細胞核內Nrf2進一步增加，推測這種顯著上升有利于肺臟保護，清楚多余的自由基，但當預處理ATM抑制劑KU-55933時，Nrf2增加程度略有下降，經灰度掃描后，同Sev組相比，Sev/KU組Nrf2表達呈明顯下降(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 各組血清SOD活性水平及MDA含量及肺組織p-ATM、γ-H2AX、PKC、Nrf2蛋白表達水平

與Sham組比較:1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05；與Sev組比較:3)P<0.05

圖1 各組肺組織p-ATM、γ-H2AX、PKC、Nrf2蛋白表達

3 討 論

LIRI可在多種外科臨床手術中發生，肺由于其氣體交換的功能特質，較其他器官而言，對缺血有一定耐受性，但有害物質仍舊產生；由于肺部具有豐富的微血管，再灌注時觸發一系列的級聯反應，出現肺部功能障礙和結構損傷的現象，導致肺水腫、肺出血、肺動脈高壓等癥狀〔4〕。這一過程發生發展機制非常復雜，目前以氧自由基增多等氧化應激的研究較為深入。

本研究發現，I/R損傷可以直接產生有害的自由基和過氧化脂類，降低SOD和升高MDA水平，導致組織內氧化還原反應系統失衡和氧化應激損傷，在該過程中，ATM、PKC、Nrf2信號通路被激活，從而啟動下游抗氧化反應，對抗過量生成的氧自由基。在缺血過程中吸入Sev時，可進一步激發上述信號通路，啟動更強烈的抗氧化反應，而對ATM進行抑制時，該信號通路中的PKC、Nrf2也受到抑制，揭示ATM參與了抗氧化應激壓力過程。

LIRI發生時，大量生成的氧自由基產生毒性效應，啟發膜脂質過氧化，氧化各種蛋白呈失活狀態，以至于遺傳物質的損傷〔5〕。膜脂質過氧化使生物膜功能改變，影響膜上各種受體、通道蛋白的生物學功能，從而引起，胞內信號傳遞和一系列細胞生物學反應，如促凋亡、促炎和抗增殖等生物效應，導致細胞損傷和臟器損傷〔6〕。輻射、化學試劑及I/R可升高細胞內的氧化壓力，造成基因組的損傷，從而激活胞內ATM通路及其相關的DNA修復反應，如細胞周期阻滯、細胞老化或細胞程序性死亡，從而保證遺傳信息的穩定傳遞。ROS誘導DNA損傷后，ATM激酶通過自磷酸化而激活，組成有活性的ATM二聚體〔7～9〕，進一步誘發了γ-H2AX的磷酸化〔10〕，從而激活下游各種通路，包括p53、PKC、AKT、mTOR、AMPK等等〔11〕。ATM通路錯綜復雜，下游通路存在大量的交叉通路，多種蛋白之間功能相互覆蓋，例如，目前已發現，當ATM激活時，可對下游700多個蛋白產生不同的變化〔12〕。本研究表明由于I/R刺激，導致ATM通路啟動，存在DNA修復機制。ATM通路啟動有助于損傷組織和細胞的遺傳物質修復。

PKC-Nrf2/Keap1-ARE抗氧化通路是機體內最重要的清除自由基的通路之一，在抵抗病理條件下產生的過量氧自由基、維持體內氧化還原平衡起重要的作用〔13，14〕。缺血釋放的大量刺激物質經一系列信號轉導，使存在于胞質中無活性的PKC向細胞膜轉移而被活化，磷酸化下并激活游蛋白，譬如對Nrf2起磷酸化作用；Nrf2作為一種轉錄因子，在氧化還原平衡狀態下，主要存在于細胞質中，與Keap1結合處于非活性狀態，當胞內出現過量自由基時，PKC磷酸化Nrf2使其從Keap1上解離下來，轉移進入細胞核，同核內ARE結合，啟動ARE識別調控抗氧化酶或抗炎蛋白基因的表達，增強細胞對氧化應激的抵御能力，SOD即是Nrf2/ARE啟動的下游基因之一。目前有少數研究證實了ATM和PKC的相關性，如Li等〔15〕發現在成骨細胞中，敲減ATM基因后，PKC表達相應減少，Matsuda等〔16〕發現ATM抑制劑減少了乙肝病毒上調的PKC蛋白表達。本研究揭示ATM參與了抗氧化應激的壓力過程。

Sev作為鹵族麻醉藥之一，已證實其對大鼠肺I/R模型有保護作用，其涉及的機制包括抗氧化應激反應〔3，17〕，降低炎癥反應〔17，18〕及抑制肺組織細胞凋亡作用〔19〕，但其保護作用機制仍需深入研究。本研究發現Sev的LIRI保護作用中存在ATM、PKC、Nrf2、SOD的序貫激活關系，ATM參與調控Sev的抗氧化應激作用，從而對于肺水腫等肺部損傷有緩解作用。