高效液相色譜法同時測定荔枝草提取物中迷迭香酸、高車前苷、高車前素及芹菜素含量

陳 婷，徐加兵

（江蘇省揚州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚州 225000）

荔枝草為唇形科植物荔枝草 Salvia plebeia R.Br.的全草，多生長于山坡、路旁、荒地、河邊濕地上，分布于全國各地。荔枝草味苦、辛，性涼，歸肺、胃經，具有清熱解毒、涼血散瘀、利水消腫的功效，常用于治療感冒發熱、咽喉腫痛、肺熱咳嗽、咳血、吐血、尿血、崩漏、腎炎水腫、白濁、痢疾、癰腫瘡毒、濕疹瘙癢、跌打損傷及蛇蟲咬傷等癥［1］。荔枝草主要含有黃酮及苷類、萜類、苯丙素類、多糖類等化合物［2］。現代藥理研究表明，其具有抗菌、抗氧化、保肝、降血糖、抗炎、鎮痛、止血及化痰止咳等作用［3－8］。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定荔枝草提取物中迷迭香酸、高車前苷、高車前素及芹菜素的含量，為以荔枝草為原料的功能性食品及相關新藥的開發提供試驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（美國Waters公司，含2787紫外檢測器）；旋轉蒸發儀（上海雅東玻璃制品有限公司）；微量移液器（大龍光創實驗儀器＜北京＞有限公司）；KH3200型超聲清洗機（寧波鄞州恒大超聲設備有限公司）；電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

1.2 試藥

迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111871－201706）；高車前苷對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號為P180322）；高車前素對照品（上海純優生物科技有限公司，批號為P170214）；芹菜素（中國食品藥品檢定研究院，批號為 111901－201603）；荔枝草提取物（自制，批號分別為20170906，20170914，20170925）；甲醇為色譜純（美國 Tedia 公司）；純化水（自制）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：PhenomenexC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.1% 磷酸水（A）－甲醇（B），梯度洗脫，0～8 min時 15%B～38%B，8～17 min時 38%B～56%B，17～28 min時56%B～82%B，28～35 min時82%B～95%B；流速：1 mL ／min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：335 nm。

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素對照品適量置容量瓶中，甲醇溶解并定容，配制成迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素質量濃度分別為 112.5，269.8，144.6，195.2 mg ／L 的混合對照品溶液，作為貯備液。

供試品溶液：稱取經干燥并粉碎的荔枝草適量，加10倍量水回流提取1次，再加6倍量水回流提取2次，合并3次提取液，減壓濃縮至相對密度為1.25，加95%乙醇醇沉至含醇量達50%，靜置12 h，離心取上清液，并減壓濃縮至無醇味，過HPD826大孔吸附樹脂，依次用3倍柱體積（3BV）水、2BV 15%乙醇和2BV 40%乙醇洗脫以除雜質，用75%乙醇4BV洗脫，收集洗脫液，濃縮后真空干燥，即得荔枝草提取物。稱取荔枝草提取物100 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，用75%乙醇超聲溶解，定容至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜，備用。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：在擬訂色譜條件下進樣分析，得對照品和荔枝草提取物色譜圖（圖1）。由圖1可見，迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素色譜峰的分離度良好，其他成分不干擾上述4種成分的測定。

線性關系考察：分別精密吸取混合對照品貯備液0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00 mL，置 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋，定容，搖勻。配制成分別含迷迭香酸2.812 5，5.625 0，11.250 0，28.125 0，56.250 0，112.500 0 mg／L，高 車 前 苷 6.745，13.490，26.980，67.450，134.900，269.800 mg／L，高 車 前 素 3.615，7.230，14.460，36.150，72.300，144.600 mg／L 和芹菜素 4.88，9.76，19.52，48.80，97.60，195.20 mg ／L 的系列對照品溶液。按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積，以峰面積（A）對對照品溶液質量濃度（C）進行線性回歸，得迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素的標準曲線 分 別 為 A＝5.974 9×105C ＋398.7（r＝0.999 8），A＝1.185 3×106C －339.4（r＝0.999 7），A ＝6.784 3×105C －227.3（r＝0.999 8），A ＝9.417 8×105C ＋205.6（r＝0.999 8），質量濃度分別在 2.812 5 ～112.500 0，6.745 ～269.800，3.615 ～144.600，4.88 ～195.20 mg／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取含迷迭香酸11.25 mg／L、高車前苷 26.98 mg／L、高車前素 14.46 mg／L 和芹菜素19.52 mg／L的混合對照品溶液 10 μL，按擬訂色譜條件重復進樣分析6次，記錄峰面積。結果迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素峰面積的 RSD分別為1.13%，0.85%，0.97%和 0.92% （n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 高效液相色譜圖

重復性試驗：稱取荔枝草提取物（批號為20170906）6份，每份100 mg，精密稱定，配制供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算含量。結果迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素在荔枝草 提 取 物 中 的 含 量 分 別 為 6.185，18.274，9.692，11.169 mg ／g，RSD 分別為 1.31% ，1.02% ，1.23% 和1.09% （n＝6）。

穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，15，24 h 時進樣分析，記錄峰面積。結果迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素峰面積的 RSD 分別為 1.47%，1.26%，1.51%，1.33% （n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：稱取已知含量的荔枝草提取物（批號為 20170906）6份，每份40 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入5 mL分別含迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素 56.25，134.90，72.30，97.60 mg ／L 的混合對照品溶液，甲醇定容至刻度。6份樣品進樣前均經0.45 μm濾膜濾過，進樣分析，記錄峰面積，計算回收率。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

稱取3批次荔枝草提取物各100 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣分析，記錄峰面積，計算含量。結果見表2。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

表2 樣品含量測定結果

3 討論

將迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素對照品經紫外全波長掃描，記錄最大吸收波長。結果表明，迷迭香酸在223 nm和328 nm波長處有最大吸收，高車前苷在276 nm和336 nm波長處有最大吸收，高車前素在258 nm和343 nm波長處有最大吸收，芹菜素在268 nm和339 nm波長處有最大吸收，故初步選擇335 nm作為檢測波長。經比較，當檢測波長為335 nm時，各色譜峰強度大、特異性亦較強。

選擇流動相組成及比例時，考察了甲醇－水體系與乙腈－水體系對基線、峰形及分離度等的影響。通過比較，甲醇－水體系梯度洗脫時的峰形及分離度均優于乙腈－水體系，僅基線平穩性稍差于乙腈－水體系，能較好地分離迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素4種成分，同時加入0.1%的磷酸可以獲得更優的峰形。

本研究結果顯示，荔枝草提取物中高車前苷的含量最高，為18.253 mg ／g，其他3種成分含量分別為迷迭香酸6.186 mg／g，高車前素 9.665 mg／g 和芹菜素 11.162 mg／g。

本研究中建立的HPLC法可同時測定荔枝草提取物中迷迭香酸、高車前苷、高車前素和芹菜素的含量，且方法快速，結果準確，重復性高，可作為荔枝草提取物的質量控制標準。