茶葉中鄰苯二甲酰亞胺殘留氣相色譜-串聯質譜測定

高貫威，陳紅平，柴云峰，金莉莉,2，劉新，魯成銀*

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茶葉中鄰苯二甲酰亞胺殘留氣相色譜-串聯質譜測定

高貫威1，陳紅平1，柴云峰1，金莉莉1,2，劉新1，魯成銀1*

1.中國農業科學院茶葉研究所 農業部茶葉產品質量安全風險評估實驗室 農業部茶葉質量安全控制重點實驗室，浙江 杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081

鄰苯二甲酰亞胺（PI）和滅菌丹總量作為滅菌丹殘留限量標準，造成茶葉中滅菌丹檢測的假陽性誤判，成為阻礙我國茶葉出口主要因素之一。本文優化了QuEChERS前處理條件，建立了氣相色譜串聯質譜法檢測茶葉中PI殘留的方法。樣品經乙腈提取，多壁碳納米管、十八烷基硅烷和苯磺基強陽離子交換劑組成的混合分散吸附劑凈化。在10、20、50、100?μg?kg-1添加水平下，回收率為73%~104%，相對標準偏差低于20%。方法定量限為10.0?μg?kg-1。該方法簡便、可靠、準確，靈敏度高，適用于茶葉中PI殘留檢測。

茶；鄰苯二甲酰亞胺；QuEChERS；氣相色譜-串聯質譜

鄰苯二甲酰亞胺（Phthalimide, PI），是殺菌劑滅菌丹、殺蟲劑亞胺硫磷、除草劑滅草松等化學農藥的合成中間體和降解產物。化學農藥滅菌丹、亞胺硫磷、滅草松等的使用造成農產品中PI污染[1]。PI與酞酐分子結構相近，酞酐在加熱條件下與氨基化合物反應可生成PI。因此，環境中酞酐的污染及化學農藥的使用均可造成茶葉中PI殘留。2016年，歐盟修改了滅菌丹殘留標準，將滅菌丹最大殘留限量MRL由50?μg?kg-1更改為100?μg?kg-1，然而，由于將降解產物PI及滅菌丹的總和作為滅菌丹殘留，導致我國茶葉出口多次受到歐盟海關通報，其主要原因是茶葉中檢出PI，部分樣品檢出水平高于歐盟MRL值。目前，我國茶葉中PI檢測方法標準處于缺失狀態，相關檢測方法也未見報道。因此，我國茶葉中PI殘留水平及來源尚不清晰，亟待開發茶葉中PI檢測方法。

PI檢測方法主要包括儀器分析和樣品前處理技術。目前，PI檢測通常采用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術[2-6]。前處理主要包括提取和凈化兩個步驟。研究表明，乙腈對PI具有良好的溶解能力，且對植物樣品基質的滲透能力較強，因此乙腈常被用來提取植物性樣品中的PI[2]。凈化主要目的是去除或減少樣品基質，降低基質對PI檢測的干擾。Cunha等[2]利用GC-MS建立了橄欖中PI含量的檢測方法，其定量限（LOQ）較高（75?μg?kg-1），且線性相關系數（2）低于0.95。Li等[5]采用QuEChERS前處理技術，建立了蔬菜和水果中PI的GC-MS/MS檢測方法，該方法LOQ為34?μg?kg-1。

茶葉富含多酚、多糖、咖啡堿、色素等成分，茶葉基質不僅干擾目標化合物的定性定量分析，同時造成儀器污染，增加儀器維護成本。因此，茶葉樣品中痕量物質前處理具有更高的要求。本文根據茶葉發酵程度，選取綠茶（未發酵）、烏龍茶（輕發酵）和紅茶（全發酵）為研究對象，優化了QuEChERS前處理條件，建立了茶葉中PI殘留GC-MS/MS檢測方法。本方法簡便、快速、準確，靈敏度高，線性關系良好，方法LOQ遠低于歐盟MRL值，適用于茶葉中PI殘留量的檢測，為探究茶葉中PI污染水平及來源和保障我國茶葉出口提供了可靠的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

PI標準品來自上海安譜科學儀器有限公司。將PI標準品配制成濃度為1?000?μg?mL-1的丙酮標準溶液，采用乙腈稀釋至所需質量濃度，得到標準中間液（1~500?μg?L-1）。所有標準溶液均在4℃條件下保存備用。茶葉樣品（綠茶、烏龍茶和紅茶）購于超市或茶葉專賣市場。

乙腈、丙酮均為色譜純（德國Merck公司），超純水由法國Millipore超純水系統制得。乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化碳黑（GCB）、多壁碳納米管（MWCNTs）、十八烷基硅烷（C18）、佛羅里硅土（Florisil）由天津博納艾爾公司提供，三甲基氨丙基強陰離子交換劑（SAX）、苯磺基強陽離子交換劑（SCX）、碳十八鍵合鋯膠（Z-Sep+）和硅膠（Si）從上海安譜科學儀器有限公司購得，氯化鈉（NaCl）、無水硫酸鎂（MgSO4）來自杭州華東醫藥有限公司。

Varian 450GC-300MS氣相色譜-串聯質譜聯用儀（美國瓦里安公司），DFT-50手提式高速萬能粉碎機（浙江溫嶺林大機械有限公司），旋轉混勻儀（上海京工實業有限公司），多管渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司），高速冷凍離心機（上海盧湘儀有限公司）。

1.2 樣品前處理

茶葉樣品粉碎后，稱取2.5?g置于50?mL離心管中，加入5?mL純水，渦旋1?min后加入10?mL乙腈，渦旋1?min，旋轉提取30?min。稱取4.0?g MgSO4和2.0?g NaCl于離心管，渦旋1?min，4?500?r·min-1離心10?min，移取2?mL上清液到5?mL離心管中（內有20?mg MWCNTs，100?mg C18，200?mg SCX），渦旋1?min，4?500?r·min-1離心10?min，上清液過 0.22?μm濾膜至自動進樣瓶，待GC-MS/MS分析。

1.3 色譜、質譜條件

色譜柱：VF-5MS 毛細管柱30?m×0.25?mm×0.25?μm。色譜條件：柱溫起始溫度80℃，保持1?min，以30℃?min-1速率升溫到280℃，保持12 min。進樣口溫度220℃。載氣：高純氦氣（99.999%）。分流方式：不分流。進樣量：1?μL。流速：1.0?mL?min-1。

離子源為電子轟擊離子（EI）源，其能量為70 eV，離子源溫度為230℃, 四極桿溫度為40℃，溶劑延遲4 min。PI保留時間為5.10?min，定量離子（147>76）和定性離子（147>103），碰撞能量（CE）分別為25和10 eV。

1.4 質量控制

為保證數據的準確性，每個樣品設置3個重復，取平均值。按照1.2樣品前處理方法，GC-MS/MS分析后，篩選出PI含量較低的3個茶葉樣品（綠茶、烏龍茶和紅茶）。經1.2前處理中得到茶葉基質，并在基質中加入PI標準品，使得標準加入濃度（）為1、2、5、10、20、50、100、200、500?μg?L-1。采用標準加入法計算茶葉樣品中PI本底，即以為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線與橫坐標交點處橫坐標絕對值即為茶葉基質溶液PI含量（C）。

為降低基質效應對茶葉中PI定量準確度的影響，本文以茶葉基質匹配標準溶液中PI進樣濃度（C+C），定量離子對峰面積為縱坐標建立校正標準曲線，采用校正標準曲線對茶葉中PI進行定量。

2 結果與討論

2.1 色譜及質譜條件優化

色譜條件優化的主要目的是增大目標物之間或目標物與雜質之間的分離度，提高檢測的靈敏度與準確度。本文僅PI一個目標物質，初始溫度（80℃）保持1?min后，以30℃?min-1的速率升溫至280℃，保持12?min，單個樣品檢測時間不超過20?min，提高了樣品檢測的效率。

質譜條件的優化過程如圖1所示，首先在全掃描模式（50~200）下得到PI的保留時間，以及特征離子碎片。以特征性和豐度相對較高的離子碎片（147）作為母離子，經二級質譜碎裂得到子離子（147>76和147>103）。碰撞能量（CE）是子離子豐度的關鍵影響因子，因此在MRM多反應監測模式下進行CE值的優化，得到147>76和147>103最優CE值分別為25、10 eV（圖1）。由圖1所示，147>103離子豐度較高，然而茶葉基質標準溶液中147>103信噪比（47），遠低于147>76（126），因此本文選擇147>76為PI的定量離子對，147>103為定性離子對。本方法采用對比樣品與溶劑標樣中目標物質的保留時間、定量及定性離子對、相對豐度比三重方法對PI精準定性。

2.2 前處理條件優化

研究表明，乙腈對PI溶解度較高，且對茶葉基質具有良好的滲透能力[2,7]。茶葉用水浸潤之后再經有機試劑提取可提高茶葉中極性化合物的提取效率[8]。因此本文選擇乙腈作為茶葉中PI的提取試劑，并在提取之前將茶葉用水浸濕。

混合分散吸附劑的種類和用量是影響QuEChERS方法中目標物質回收率和基質凈化效果的關鍵因子[9-10]。本文比較了9種QuEChERS方法中常用的吸附劑（GCB、MWCNTs、C18、PSA、Z-Sep+、Florisil、SCX、 SAX和Si）對PI回收率的影響與茶葉基質的凈化效果。其中，GCB 和MWCNTs比表面積大，對茶葉基質具有良好的去除作用，但也可能對目標物質產生嚴重的吸附[11]，因此需要對GCB 和MWCNTs用量進行探究。將2?mL乙腈和初始茶葉乙腈提取液配置的PI標準溶液（100?μg?L-1）分別加入到上述不同吸附劑中（GCB為20、50、100、200?mg，MWCNTs為10、20、50、100?mg，其他材料均為200?mg），考察乙腈和茶葉乙腈提取液中9種吸附劑對PI回收率的影響與茶葉基質的去除效果。

注：a：全掃描；b：二級質譜碎裂；c：m/z 147>76 CE值優化；d：m/z 147>103 CE值優化；e：m/z 147>76提取離子流圖；f：m/z 147>103提取離子流圖。

由圖2-a所示，乙腈標準溶液經PSA、Z-Sep+和SAX吸附處理后，12%~47%的PI被吸附。另外，PI分子存在平面的苯環結構，因此GCB 和MWCNTs對PI表現出很強的吸附作用，隨著GCB（20~200?mg）和MWCNTs（10~100?mg）用量的增加，乙腈配制的標準溶液中PI回收率隨之降低，甚至完全被吸附（圖2-b）。茶葉基質標準溶液中，基質與吸附劑存在競爭吸附目標物的現象[11-12]。從圖2中可以看出，GCB和MWCNTs用量分別在100~50?mg以內及其他7種吸附劑在200?mg用量水平上，茶葉乙腈提取液中PI回收率在95%~114%之間，說明茶葉基質標準溶液中，9種吸附劑在相應用量水平上對PI基本沒有吸附。

前期研究表明，MWCNTs、GCB和C18可有效降低茶葉乙腈提取液的顏色深度，其中MWCNTs凈化效果最佳[13-14]。MWCNTs與GCB吸附作用相近，可有效降低乙腈提取液中茶多酚、咖啡堿、葉綠素等雜質含量[14]。當MWCNTs用量達到20?mg時，茶葉乙腈提取液顏色從深綠色變為淺綠色，達到相近凈化效果時用量明顯低于GCB（100?mg）[13]，因此本文選用20?mg MWCNTs作為QuEChERS方法中的吸附劑。C18 具有較強的疏水作用，對脂肪酸等弱極性雜質具有良好的吸附效果[9]。在50~100?mg范圍內，隨著用量的增加C18對茶葉乙腈提取液的脫色效果逐漸增強，而100?mg與200?mg用量下脫色效果差異不明顯。本試驗結果發現，茶葉乙腈提取液經200?mg的PSA、Florisil、SAX 、Z-Sep+和Si凈化前后顏色差異較小，該結果與前期研究相符[13-14]。PSA和Florisil是QuEChERS方法中常用的吸附劑，然而PSA和Florisil對茶多酚、咖啡堿、葉綠素的吸附作用可由MWCNTs代替[14]。SCX是一種強陽離子交換吸附劑，對茶葉中的油脂和有機酸類等物質有一定的吸附作用，且用量達到200?mg時脫色效果最佳。

綜合PI的回收率和茶葉基質的凈化效果，本文選擇20?mg MWCNTs、100?mg C18和200?mg SCX作為QuEChERS方法中混合分散吸附劑。經混合吸附劑凈化后，茶葉乙腈提取液顏色從深綠色變為淺黃色，PI回收率在92%~102%之間，滿足本試驗要求。

圖2 不同種類吸附劑（a）及不同用量GCB、MWCNTs（b）對乙腈和茶葉基質標樣（100 μg?L-1）中PI的吸附效果

2.3 基質效應和線性范圍

按照1.2樣品前處理方法和1.3儀器條件對茶葉樣品檢測，選取PI殘留水平較低的綠茶、烏龍茶樣品，以及PI空白紅茶樣品。經1.2前處理后得到基質溶液，配制PI基質標準溶液，使得標準加入濃度（）分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500?μg?L-1。GC-MS/MS分析后，根據1.4中標準加入法計算得到綠茶和烏龍茶基質溶液PI含量（C）分別為1.0和1.2?μg?L-1。以基質溶液進樣濃度（C+C）為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標建立標準校正曲線。由表1可以看出，PI在相應的范圍內響應值與質量濃度線性關系良好（2>0.99）。

基質效應對目標物質的分析有明顯干擾，影響目標物質分析結果的準確性。根據相同濃度下乙腈標準溶液和茶葉基質標準溶液PI定量離子對峰高的對比，茶葉基質對PI響應值具有較強的基質增強效應（圖3）。從色譜峰形上看，乙腈標準溶液中PI產生嚴重的拖尾現象，影響PI定量分析，而基質標準溶液PI色譜峰具有良好的對稱性。為降低基質效應對茶葉中PI分析的影響，本文采用茶葉基質匹配標準溶液繪制的標準校正曲線對茶葉中PI進行定量。

2.4 回收率、精密度、定量限和檢出限

選取PI空白紅茶樣品，按照1.2前處理方法，在10?μg?kg-1添加水平下進行回收率預試驗（n=3），結果表明PI回收率在75%~90%之間。選取PI殘留水平較低的綠茶（4.0?μg?kg-1）、烏龍茶（4.8?μg?kg-1）及PI空白紅茶樣品。在10、20、50、100?μg?kg-1水平下進行回收率試驗，每個水平重復5次。結果如表1所示，在4個加標水平下，3種茶葉中PI回收率在73%~104%之間，RSD為10%~19%，符合歐盟關于食品中農藥殘留檢測回收率和精密度限定。本文將3種茶葉中PI的LOQ值設定為10.0?μg?kg-1。方法檢出限（LOD）按3倍信噪比（）確定，如表1所示，綠茶、烏龍茶和紅茶樣品中PI的LOD值分別為0.3、0.3、0.2?μg?kg-1。

表1 茶葉中PI線性范圍、線性方程、相關性系數（2）、回收率、檢出限（LOD）及定量限（LOQ）

Table 1 Linear range, linear equation, correlation of coefficient (R2), recovery, the limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) of PI in tea matrices

圖3 同等濃度（100 μg?L-1）的乙腈PI標準溶液（a）與茶葉基質標準溶液（b）提取離子流圖

2.5 實際樣品檢測

采用本方法對綠茶、烏龍茶和紅茶各20個樣品中的PI殘留進行檢測，其中綠茶和烏龍茶樣品產自中國，紅茶樣品中10個產自中國（No.1~No.10），10個來自斯里蘭卡（No.11~ No.20）。由圖4顯示紅茶樣品中PI空白樣品、添加標準樣品、基質標準溶液、陽性樣品提取離子流圖。綠茶、紅茶和烏龍茶樣品PI的殘留水平如表2所示，綠茶、烏龍茶樣品中均檢出PI，殘留水平分別在

3 結論

本文通過優化QuEChERS前處理方法和GC-MS/MS儀器條件關鍵參數，建立了茶葉中PI殘留的GC-MS/MS檢測方法，能夠對茶葉中PI進行準確的定性和定量檢測。采用茶葉基質匹配標準溶液繪制的標準校正曲線對茶葉中PI進行定量，降低了基質效應對定量準確度的影響。結果表明，方法LOQ低于歐盟MRL值，回收率與精密度滿足茶葉中PI檢測要求。

表2 茶葉樣品中PI殘留水平（μg?kg-1）及檢出率

Table 2 The positive rates and concentration levels (μg?kg-1) of PI detected in actual tea samples

注：數值指平均值±標準偏差（n = 3）；紅茶樣品中1~10 號來自中國，11~20 號來自斯里蘭卡；

Note: Values are mean ± standard deviation (n = 3). Black tea samples of number 1-10 were from China, number 11-20 were from Sri Lanka.

圖 4 紅茶樣品中PI空白樣品（a）、添加標準樣品（b, 50 μg?kg-1）、基質標準溶液（c，12.5 μg?L-1）、陽性樣品（d，35.8 μg?kg-1）提取離子流圖

致謝：感謝中國農業科學院茶葉研究所肖強研究員提供歐盟滅菌丹殘留限量標準文件。

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Determination of Phthalimide Residue in Tea Using Gas Chromatography-tandem Mass

GAO Guanwei1, CHEN Hongping1, CHAI Yunfeng1, JIN Lili1,2, LIU Xin1, LU Chengyin1*

1. Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Tea Quality and Supervision Testing Center, Key Laboratory of Tea Quality and Safety Control, Ministry of Agriculture R. P. China, Hangzhou 310008, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

As folpet residues, phthalimide (PI) and folpet were responsible for a high risk of false positive detection of folpet in tea, which became a major factor restricting the export of Chinese tea. A modified QuEChERS method for the determination of PI residue in tea using gas chromatography-tandem mass was developed and validated. The target analyte was extracted using acetonitrile and the crude extracts were purified using multiwalled carbon nanotubes, octadecyl silica and strong cation exchanger. At the spiked levels of 10, 20, 50 and 100?μg?kg-1, the average recoveries were from 73% to 104%, and the relative standard deviations were below 20%. The limit of quantification of PI in tea was 10.0?μg?kg-1. The method was simple, reliable, accurate, sensitive and appropriate for the determination of PI residue in tea.

tea, phthalimide, QuEChERS, gas chromatography-tandem mass

TS272.5

A

1000-369X(2018)04-416-09

2018-02-07

2018-03-07

中國農業科學院創新團隊茶葉質量與風險評估團隊項目（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS-06）；浙江省公益應用項目（2017C32059）；現代農業產業技術體系建設專項基金資助項目（nycytx-26）

高貫威，男，山東菏澤人，科研助理，主要從事茶葉質量安全檢測與研究。*通訊作者：lchy@mail.tricaas.com