利用SSR技術鑒定玉米雜交種家佳榮2號”的種子純度

李 陽，范夢偉，季曉坤，賈相初,3，吳 彬，趙自仙*，王德海

(1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南盛衍種業有限公司，云南 玉溪 653100；3.鎮雄縣種子管理站，云南 鎮雄 657200；4.開遠市植檢植保站，云南 開遠 661699；5.云南省種子管理站，云南 昆明 650031)

玉米是雜種優勢利用最成功的作物之一。【研究意義】高純度的玉米雜交種子是充分發揮雜種優勢的基礎，雜交種子的純度直接影響農作物的產量、品質和農戶的收成。種子純度是評定種子質量等級的主要指標之一，玉米雜交種子純度鑒定是玉米種子質量控制體系中的關鍵環節，傳統的形態鑒定法依賴于品種表型差異，受環境影響較大、工作量大、鑒定周期長、成本高、易受季節限制，影響種子質量檢測、監督的速度和質量[1]。【前人研究進展】純度鑒定的方法也很多，同工酶和種子貯藏蛋白等生理生化標記存在著多態性不夠豐富、組織和器官特異性差、穩定性差等問題，也限制了在玉米雜交種純度鑒定中的應用。其中，蛋白鑒定因種子貯藏蛋白質為基因表達產物，種類有限、多態性差，且結果表達并非完全互補，所以，該技術不能應用于所有玉米單交種的純度鑒定[2]。例如‘農大108’用了近2年時間才找到特異性蛋白譜帶，‘豫玉27’也存在同樣情形，這給品種純度鑒定帶來很大問題[3]。田間小區種植鑒定是在幼苗至成熟期間，根據不同品種的特征特性鑒別出異型植株的方法。該方法的鑒定依據是植株的形態特征和生育特性的差異。這些性狀主要是指株高、株形、葉形和葉色、花形和花色、穗形和穗色、芒的有無、長短和顏色、粒形和粒色、抗病性和生長特性等。適用于貿易、調種的仲裁檢驗，也是經濟糾紛的依據。田間小區植株鑒定是被認可的品種鑒定的可靠方法，但田間小區種植鑒定要在玉米整個生育期進行，鑒定周期長，此外還受鑒定人員的專業水平、環境等的影響，從而影響鑒定結果的準確性。隨著科學技術的進步，玉米種子純度的檢驗方法已從蛋白鑒定逐漸向分子標記鑒定發展[4]，對于玉米雜交種的純度和真實性鑒定，SSR分子標記技術具有獨特的優越性，SSR標記具有共顯性、重復性好、多態性高、擴增結果穩定、檢測手段簡便易行等特點[5]，在分子生物學和分子遺傳學發展中起著巨大的推動作用。由于SSR標記完全符合作物品種鑒定的4個基因準則：即環境的穩定性、品種間變異的可識別性、最小品種內變異和實驗結果的可靠性，因此可準確地檢測生物體中的遺傳變異[6]。SSR標記廣泛、隨機、均勻地分布于作物基因組，而且與RFLP或RAPD標記相比，SSR分子標記技術具有數量豐富、多態性好、遺傳上呈共顯性、擴增穩定、引物序列易于交流等特點，在玉米種子純度和品種真實性鑒定中得到了廣泛應用，解決了一些玉米品種利用蛋白質電泳技術無法進行純度鑒定的難題[7]。生產上如何快速、準確、簡便、經濟地鑒定玉米雜交種子純度是一個突出的問題[8]。【本研究切入點】本研究利用SSR技術，采用幼葉CTAB法和堿煮法提取雜交種‘家佳榮2號’的DNA，篩選出適合‘家佳榮2號’的玉米雜交種純度鑒定的SSR引物，比較2種DNA提取方法的優缺點，并人為摻入其他品種籽粒以驗證特異引物的可靠性。同時進行小區種植鑒定，用多種方式鑒定雜交種‘家佳榮2號’的種子純度并進行比較。【擬解決的關鍵問題】旨在為玉米的種子質量管理和純度鑒定提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料共4份，為‘家佳榮2號’雜交種及其父母本、‘JR02’雜交組合，材料由云南農業大學趙自仙老師提供，其中‘家佳榮2號’于2012年通過云南省品種審定，該品種抗病性、耐瘠性強，適應性廣，正在云南省推廣應用；‘JR02’是玉米新組合，與‘家佳榮2號’同母異父，用于人為摻假鑒定，以驗證篩選出引物的可靠性。試驗用的種子均由隨機抽樣所得，引物為20對國家標準引物序列(表1)。

表1 引物名稱及編號

續表1 Continued table 1

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 本試驗采用2種方法提取玉米基因組總DNA，140個樣品，標號為1～140。第1種方法是幼葉CTAB提取法：取幼苗葉片200～300 mg于預冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末，取適量移入2.0 mL離心管；加入700 μl 65 ℃預熱的CTAB提取液和2 μl β-巰基乙醇，上下充分搖勻，放入65 ℃水浴鍋中，每15 min拿出顛倒混勻3次，至1.5 h后拿出靜置10 min至室溫；在離心機中12 000 r/min離心15 min，吸取上清液到新離心管，加入等體積預冷的氯仿異戊醇，顛倒搖晃離心管10 min，重復上一步，在4 ℃離心機中12 000 r/min離心15 min，吸取上清液到新離心管中，加入等體積預冷異丙醇，在-20 ℃下放置30 min沉淀[9]；然后置于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入70 %乙醇洗滌，旋轉離心數次，棄去乙醇；將離心管倒立于墊有濾紙的實驗臺上，室溫干燥6 h以上；加入100 μl超純水或TE緩沖液，充分溶解后存于-20 ℃備用。另1種方法是單籽粒微量胚乳堿煮法提取DNA：將籽粒種皮沿一側輕輕切下，切1～3薄片胚乳放入PCR管中；加入100 μl提取液(0.1 mol/L NaOH)和少量甘油，蓋蓋；放入PCR擴增儀中99 ℃，10 min；取出后，降到室溫，加入100 μl TE(1 mol/L Tris-HCl 5 mL，0.5 mol/L EDTA 1 mL，濃鹽酸調pH=2，定容至500 mL，存于4 ℃備用。

1.2.2 DNA質量檢測 每管DNA都用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，一大板(160 mL)瓊脂糖凝膠制備：①安裝好制膠器；②稱取1.6 g瓊脂糖倒入三角瓶中，在三角瓶中加入160 mL 1(TBE緩沖液并搖勻；③將三角瓶放入微波爐加熱，每隔20 s拿出搖晃，直到氣泡全部溢出，反復操作，直至溶液呈無色透明為止；④冷卻至不明顯燙手后，加入少量(7 μl)核酸染料并輕輕搖勻，防止產生氣泡；⑤從膠槽一側緩慢倒入槽中，迅速插入梳齒，待冷卻凝固后拔掉梳齒。將制好的凝膠放入裝有1×TBE電泳緩沖液的電泳槽內，點樣，在100 V、120 mA條件下電泳40 min左右，取出凝膠并在凝膠成像系統儀中觀察結果。

1.2.3 引物篩選 從中華人民共和國農業行業標準(NY/T 1432—2014)附錄C核心引物名單及序列中選擇前20對引物[10]，利用1.5 %瓊脂糖凝膠電泳和8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對20對引物的退火溫度及擴增效果進行篩選。

1.2.4 PCR擴增 反應體系15 μl：10×PCRbuffer 1.5 μl；Mg2+0.9 μl；dNTP 0.3 μl；1UTaq酶0.275 μl；Primer(L+R)0.5 μl+0.5 μl；模版DNA 1 μl；ddH2O 10.075 μl。配體系的時候注意要在低溫條件下操作，并且保證實驗臺清潔和操作的時候要盡量避免受到污染。配制完成后在反應液上加入15 μl石蠟油(防止反應過程中體系溶液蒸發)，加蓋放入PCR擴增儀擴增。

反應程序：第1步：94 ℃預變性4 min，1個循環；第2步：94 ℃變性45 s，退火35 s(退火溫度因引物不同而不同)，72 ℃延伸45 s，共32個循環；第3步：72 ℃延伸7 min，1個循環；4 ℃保存。

1.2.5 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 ①制膠灌膠。先把用水沖洗和乙醇擦過的玻璃板組裝在垂直電泳儀上，然后開始灌膠，配制凝膠組分見表2。灌膠時要迅速，防止氣泡產生。灌完膠之后輕輕插入梳子，置于通風櫥中凝固1 h。②電泳。將1×TBE緩沖液加入電泳槽中，垂直向上拔出梳子，清除點樣孔中的氣泡。50 W恒功率預電泳30 min，暫停電泳儀進行點樣，每個孔加4.5 μl PCR產物，點完樣后繼續電泳1.5 h。電泳結束后，小心分開兩塊玻璃板，凝膠會緊貼在有凹槽的玻璃板上。③銀染。先將電泳結束后脫下來的膠在ddH2O漂洗2次，每次20 s；然后在銀染液中輕輕晃動染色10 min(避光)，用ddH2O漂洗2次，每次10 s；再在顯影液中輕輕晃動至帶紋出現，用ddH2O漂洗1次，10 s；最后在10 %冰乙酸定影5 min，用ddH2O漂洗1次，20 s；在看膠臺上分析帶譜。

表2 8 %非變性聚丙烯酰胺膠

1.2.6 摻雜驗證SSR方法可靠性 提取與‘家佳榮2號’同母異父的雜交種‘JR02’的DNA，然后分別用phi072k4引物和bnlg2291k4引物對其進行擴增，然后檢測擴增產物，與雜交種‘家佳榮2號’及其親本產物進行對比。

1.2.7 田間小區種植鑒定 取與室內SSR純度鑒定同一批次的種子樣品作為田間鑒定的標準樣品，于2015年5月21日播種于尋甸縣大河橋云南農業大學實習基地。試驗地塊肥力中等，前作無玉米種植。小區行長3 m，行距0.75 m，穴播，穴距0.42 m，每穴播2粒，種植密度63 510株/hm2，合計種植210粒，最終成株163株。根據種子檢驗技術規程及國家種子質量標準，玉米大田用種的種子純度要求96.0 %以上，需種植株數為400/(100-96)株，即100株可獲得滿意結果，本次試驗符合標準。生長期間不定苗、不間苗，及時防蟲，以保證純度鑒定的真實性，田間管理如大田，于開花期和成熟期進行純度鑒定。

2 結果與分析

2.1 雜交種‘家佳榮2號’及其親本的DNA提取和檢測

本實驗用CTAB法和快速堿煮法2種方式提取DNA，結果表明，CTAB法提取的DNA質量相對較高，量多，品質好，可以長期保存，只是操作步驟繁瑣，成本高，費時費工，而且需要種植幼苗。快速堿煮法操作簡單，步驟少，節省成本和省時省工，但該方法提出的DNA的質和量都比CTAB法提出的要差，蛋白質含量較高，不能長期保存，也不能用于大量實驗，會出現DNA時有時無的現象。所以進行大量純度鑒定實驗時，最好選用幼葉CTAB法提取DNA，這樣結果的可靠性較高[11]。

圖1 玉米雜交種‘家佳榮2號’DNA瓊脂糖電泳檢測圖(CTAB法)Fig.1 DNA agarose gel electrophoresis diagram for corn hybrid ‘Jiajiarong No.2’(CTAB method)

圖2 玉米雜交種‘家佳榮2號’DNA瓊脂糖電泳檢測圖(堿煮法)Fig.2 DNA agarose gel electrophoresis diagram for corn hybrid ‘Jiajiarong No.2’(Alkali cooking method)

2.2 引物篩選

從中華人民共和國農業行業標準(NY/T 1432—2014)附錄C核心引物名單及序列中選擇前20對引物，利用1.5 %瓊脂糖凝膠對20對引物的退火溫度進行初步篩選。瓊脂糖凝膠電泳擴增的PCR產物見圖3，引物為phi072k4。由圖3可見，6個溫度梯度，瓊脂糖凝膠電泳分辨率不高，擴增帶不易分開，無法清晰看到雙親互補的特征譜帶。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳見圖4，依據親本帶互補原則篩選引物，根據條帶亮度、清晰度、無拖尾原則篩選引物溫度，結果表明：phi072k4引物(編號7)和bnlg2291k4引物(編號8)的擴增產物呈現雙親互補的特征譜帶。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物Fig.3 PCR products analyzed by agarose gel electrophoresis

圖4 非變性聚丙烯酰胺膠分析PCR產物Fig.4 PCR products analyzed by non-denaturing polyacrylamide gel

泳道M為100 bp DNA ladder；泳道1～20為材料的序號Lane M was 100 bp DNA ladder；Lanes 1 to 20 represented the number of materials圖5 引物phi072k4對‘家佳榮2號’及其親本PCR產物電泳結果Fig.5 PCR products electrophoresis results of primer phi072k4 for ‘Jiajiarong No.2’ and its parents

泳道M為100 bp DNA ladder，泳道1～19為材料的序號Lane M was 100 bp DNA ladder；Lanes 1 to 19 represented the number of materials圖6 引物bnlg2291k4對‘家佳榮2號’及其親本PCR產物電泳結果Fig.6 PCR products electrophoresis results of primer bnlg2291k4 for ‘Jiajiarong No.2’ and its parents

2.3 樣品SSR純度鑒定

如圖5～6所示，SSR標記可以準確地區分雜交種‘家佳榮2號’及其父母本，用引物phi072k4對‘家佳榮2號’進行純度鑒定時，共提取140株幼苗DNA，共檢測出5株雜株。用引物bnlg2291k4對‘家佳榮2號’進行純度鑒定時，同樣的140株幼苗DNA，共檢測出4株雜株。根據朱國奇等人的研究[12]，選用純度較低的結果為準進行計算。玉米雜交種‘家佳榮2號’的種子純度為(140-5)/140×100 %=96.4 %。為了避免在PCR擴增階段出現其他不可預知的干擾或者錯誤對純度的結果造成影響，用同樣的DNA進行第2次擴增，就是重復PCR擴增和擴增產物的電泳，確保結果的準確性。第2次的結果與第1次的相同，實驗結果準確可靠。

泳道M為100 bp DNA ladder，泳道1～5為材料的序號Lane M was 100 bp DNA ladder；Lanes 1 to 5 represented the number of materials圖7 引物phi072k4對‘家佳榮2號’及其親本和‘JR02’PCR產物電泳結果Fig.7 PCR products electrophoresis results of primer phi072k4 for ‘Jiajiarong No.2’, its parental and ‘JR02’

泳道1～7為材料的序號Lanes 1 to 7 represented the number of materials圖8 引物bnlg2291k4對‘家佳榮2號’及其親本和‘JR02’PCR產物電泳結果Fig.8 PCR products electrophoresis results of primer bnlg2291k4 for ‘Jiajiarong No.2’, its parental and ‘JR02’

2.4 人為摻雜驗證

從圖7～8可見，篩選出的phi072k4、bnlg2291k4引物能夠明顯區分出‘JR02’摻雜粒。圖7為引物phi072k4對JR02的擴增產物電泳圖，可知‘JR02’比‘家佳榮2號’的擴增產物少了一條父本帶，一共摻雜3粒，全部均能檢測出來。圖8為引物bnlg2291k4對‘JR02’的擴增產物電泳圖，‘JR02’比‘家佳榮2號’的擴增產物多了一條清晰的帶，一共摻雜3粒，均能全部被檢測出來。

2.5 田間小區種植鑒定

‘家佳榮2號’于2015年7月23日抽雄，7月25日抽絲，第1次于7月26日進行純度鑒定，鑒定了163株，異形株數為0，以成熟期鑒定結果為準。第2次鑒定于2015年10月3日，根據植株高矮、株型及果穗形狀、粒色、粒刺的有無、粒型等，結合果穗大小等性狀進行鑒定，‘家佳榮2號’總計163株，自交系4株，無其他異形株，純度(163-4)/163×100 %=97.5 %。

3 討 論

玉米雜交種純度鑒定對玉米種子質量管理具有重要意義；同時，隨著玉米商業育種效率的提高和二環系選育的廣泛應用，現在很難找到一對SSR引物能鑒定玉米雜交種純度，所以往往采用少數引物的組合。玉米SSR標記具有豐富的多態性，利用已經研發出的近2 000對玉米SSR引物，可以篩選出任何一個玉米雜交種純度鑒定的相應的SSR引物。本試驗從20對SSR標準引物中篩選出2對引物能對‘家佳榮2號’進行純度鑒定，可以滿足‘家佳榮2號’的純度鑒定[13]。若將引物的數目增加，可能還能找到更多的適宜引物。SSR標記數量多，具有很高多態性，帶型易于區分判斷，能區分純合基因型和雜合基因型，是一項很有潛力的技術，但是在SSR分析前，需要對物種進行一系列分析。在本研究中，采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳通過銀染顯色檢測，該方法的分辨率比變性聚丙烯酰胺凝膠低，但降低了試驗成本與危險性，且分辨率高于瓊脂糖凝膠，8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠能滿足玉米純度的分析研究[14]。

田間小區種植鑒定是監控品種是否保持特有的特征特性或符合種子質量標準要求的主要手段之一。在田間小區鑒定時，品種特征、特性豐富，性狀多種多樣，鑒定可靠，對異花授粉作物純度鑒定尤為重要[15]，所以田間小區種植鑒定是目前種子生產經營和管理最重要、準確、可靠的純度和真實性鑒定方法。但是該方法的鑒定周期較長，還會受到環境的影響，在田間管理和種植方面的要求較高，對檢驗員的田間鑒定經驗、品種特征特性熟練程度要求也高。

4 結 論

通過2種DNA提取方法的結果比較可知，幼葉CTAB法提取的DNA比較適合用于玉米種子純度的分子鑒定。通過篩選引物、PCR擴增、電泳檢測等環節，找到了玉米雜交種‘家佳榮2號’種子純度鑒定的特異性引物為phi072k4(編號7)和bnlg2291k4(編號8)，根據雙親帶型特征，鑒定出雜交種‘家佳榮2號’的種子純度為96.4 %(根據引物phi072k4)。摻雜實驗中，一共摻雜6粒異品種的籽粒均能被全部檢測出來。小區種植鑒定試驗的純度為97.5 %，室內分子鑒定和小區種植鑒定的結果一致，表明研究結果可靠，方法正確。本研究建立了一套簡單、快速、準確、可靠并能夠滿足SSR標記對玉米雜交種純度鑒定的DNA提取方法，為玉米種子質量控制和純度鑒定提供了參考依據。