核酸免提取HBV-DNA檢測方法性能評價

張春嬌，仲崇明

(南京中醫(yī)藥大學(xué)連云港附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港222004)

乙型病毒肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種世界性傳染疾病[1]。血液中乙型肝炎病毒DNA（HBV－DNA）可反映患者體內(nèi)病毒活動狀況，對臨床診斷、判斷預(yù)后、指導(dǎo)用藥及治療監(jiān)測起到了重要作用[2－4]。中國是病毒性肝炎的高發(fā)地區(qū)[5]。快速、簡便、特異、靈敏的實驗室檢測技術(shù)對HBVDNA 檢測非常重要[6－12]。 目前，檢測 HBV－DNA 方法較多，其中，煮沸法操作步驟繁瑣，快速而性能良好的方法才能較好適應(yīng)臨床需求。核酸免提取方法操作簡便，本文通過分析核酸免提取HBVDNA熒光定量PCR法的精密度、準(zhǔn)確度、線性、最低檢測限，并將結(jié)果與傳統(tǒng)煮沸法進行比對，評價該法的檢測性能。

1 材料與方法

1．1 質(zhì)控血清及標(biāo)準(zhǔn)血清為北京康徹斯坦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，15例患者血清標(biāo)本來源于我院診治患者。

1．2 儀器與試劑 ABI－7500熒光定量基因擴增儀購于美國應(yīng)用生物技術(shù)有限公司，八連管離心機購于蘇州潤達(dá)生物技術(shù)有限公司，免提取核酸法試劑及標(biāo)準(zhǔn)品均購于湖南圣湘生物技術(shù)有限公司，批號2017013。煮沸法試劑及標(biāo)準(zhǔn)品均購于西安天隆生物技術(shù)有限公司，批號20160902。

1．3 方法

1．3．1 HBV－DNA提取與檢測 煮沸核酸提取法，按照天隆公司HBV－DNA熒光定量PCR檢測試劑盒說明書要求操作。核酸免提取法，按照湖南圣湘生物技術(shù)公司HBV－DNA熒光定量PCR檢測試劑盒說明書要求操作。

1．3．2 驗證指標(biāo)及驗證方法

1．3．2．1 精密度 選用高、中、低三個濃度陽性血清為待測樣本，各重復(fù)測定10次，計算SD、CV。以YY/T1182－2010《核酸擴增檢測用試劑（盒）》精密度要求（CV＜5%）為評價標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2．2 準(zhǔn)確度 具有溯源性定值血清 （北京康徹斯坦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品），HBV－DNA含量分別 為 4．6E+06IU/ML，1．41E+03IU/ML 分 別 重 復(fù) 3次檢測，計算測量平均值與認(rèn)定值偏差，以YY/T1182－2010《核酸擴增檢測用試劑（盒）》準(zhǔn)確度要求絕對值偏差不超過0．5個對數(shù)數(shù)量值為評判標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2．3 線性范圍 以煮沸法檢測 3．71E+8 IU/ML強陽性血清作為初始標(biāo)本，依次向下10倍梯度稀釋至 3．71E7 IU/ML、3．71E6 IU/ML、3．71E5 IU/ML、3．71E4 IU/ML、3．71E3 IU/ML、3．71E2 IU/ML、3．71E1 IU/ML，每個樣本（8 個）分別測定 3 次，取對數(shù)值后計算均值，將均值與理論值作線性回歸分析（Y為理論值，X為實測值），得出線性回歸分析Y=A+BX和相關(guān)系數(shù)R，以YY/T1182－2010《核酸擴增檢測用試劑（盒）》線性要求≥0．98為評判標(biāo)準(zhǔn)。

1．3．2．4 最低檢出限 根據(jù) YY/T1182－2010 《核酸擴增檢測用試劑（盒）》6．8．2 條款要求，采用乙肝兩對半全陰血清稀釋康徹斯坦定值質(zhì)控品1．41E+03IU/ML，稀釋47倍，使其達(dá)到湖南圣湘生物技術(shù)有限公司試劑聲明的最低檢出限（30IU/ML），進行25次重復(fù)檢測，以至少22次結(jié)果檢測出數(shù)值為最低檢出限通過。

1．3．2．5 將2017年8月13日我院基因擴增實驗室接收的15份血清嚴(yán)格按照煮沸法和免提取法說明書操作。比較兩種結(jié)果一致性，并將陽性結(jié)果取對數(shù)值，做相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2．1 精密度 高、中、低3個濃度的精密度變異系數(shù)均小于5%。該檢測方法符合YY/T1182－2010《核酸擴增檢測用試劑（盒）》精密度變異系數(shù)CV＜5%的要求，也符合廠家要求，見表1。

表1 精密度評價

2．2 準(zhǔn)確度 示值 4．6E+6IU/ML、1．4E+3IU/ML 定值血清測量值均值分別為 5．75E+6IU/ML，1．9E+3IU/ML，符合 YY/T1182－2010《核酸擴增檢測用試劑（盒）》5．4．2a 檢測國家標(biāo)準(zhǔn)品（或參考品）/國際標(biāo)準(zhǔn)品（或參考品），絕對值偏差不超過±0．5個對數(shù)值的要求，見表2。

表2 準(zhǔn)確度評價（示值、允許范圍、測量值為對數(shù)值）

2．3 線性 HBV－DNA 在 3．71E1 IU/ML－3．71E8IU/ML 范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系 Y=0．987X+0．071，R=0．99，符合 YY/T1182－2010《核酸擴增檢測用試劑（盒）》相關(guān)系數(shù)R≥0．98的要求，也滿足試劑盒線性范圍要求，如圖1。

2．4 最低檢出限 示值 30IU/ML（對數(shù)值為 1．48）的樣本25次檢測結(jié)果有24次出現(xiàn)定量值，對數(shù)均值 1．53，與廠家聲明的最低檢出限（30IU/ML）相符合。

2．5 兩種方法檢測結(jié)果的比對，以煮沸法為參照X，以免提取法檢測結(jié)果為Y，兩方法結(jié)果相關(guān)性分析，Y=0．979X+0．134，R=0．99，相關(guān)性良好，如圖2。煮沸法為陽性的標(biāo)本，免提取法均為陽性，煮沸法為陰性的標(biāo)本，有一例免提取法為陽性，且結(jié)果為78IU/ML，低于煮沸法的最低檢出限100IU/ML。說明免提取法的靈敏度比煮沸法要高。

圖1 線性評價

圖2 兩種方法比對

3 討論

核酸免提取HBV－DNA實時熒光定量PCR檢測性能評估結(jié)果顯示：高、中、低濃度的精密度變異系數(shù)分 0．8%、1．51%和 2．89%低于煮沸法[8，11，12]；準(zhǔn)確度與標(biāo)準(zhǔn)品的偏差分別為0．02和0，明顯低于煮沸法[8，11，12]；線性驗證的相關(guān)系數(shù) R=0．99，與煮沸法沒有區(qū)別；最低檢出限為30IU/ML，明顯低于煮沸法[8，11，12]的最低檢出限．核酸免提取方法可以及時準(zhǔn)確檢測出低拷貝的病毒，達(dá)到早診斷，早治療的目的。對15例患者血清用兩種方法同時進行檢測結(jié)果顯示兩種方法相關(guān)性良好，說明兩種方法都可應(yīng)用于臨床，核酸免提取法有更好的精密度，準(zhǔn)確度和靈敏度。本文使用核酸免提取方法精密度、準(zhǔn)確度、線性范圍、最低檢出限均符合YY/T1182－2010《核酸擴增檢測用試劑（盒）》的要求，也符合廠家說明書的要求。

目前，國內(nèi)試劑主要采用煮沸法提取HBVDNA，然后通過實時熒光定量PCR檢測DNA載量。 煮沸法測量 HBV－DNA 的性能驗證報告[8，11，12，13]顯示煮沸法操作步驟繁多，需要高溫裂解及高速離心沉淀，很容易造成DNA裂解不完全或離心沉淀不徹底，而造成DNA提取及檢測結(jié)果誤差，吸取廢液轉(zhuǎn)移反應(yīng)管時也很容易造成DNA的丟失及交叉污染。免提取核酸方法使用的核酸釋放劑，無需高溫裂解，且整個反應(yīng)過程在一個管中進行，無需移液，減少了反應(yīng)步驟，縮短了操作時間，提高了工作效率。且避免了核酸的丟失、交叉污染和人工誤差，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度、靈敏度和可重復(fù)性[14，15]。

綜上所述，核酸免提取HBV檢測方法具有精密度高，準(zhǔn)確度好，靈敏度好，操作簡便等優(yōu)點，實驗操作及檢測性能能較好地滿足臨床需求。