結直腸癌錯配修復蛋白MLH1,PMS2,MSH2和MSH6及P16的表達及意義

彭芳 ，王志 ，王建 ，張功亮 ，鐘斌

(1、贛州市人民醫院病理科，江西 贛州 341000；2、贛南醫學院第一附屬醫院藥劑科，江西 贛州 341000)

結直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來，結直腸癌的發病率逐年上升，其中有部分結直腸癌是由于錯配修復基因突變型失活或錯配修復基因甲基化失活[1－7]， 導致微衛星不穩定（MSI）， 從 而 導 致 錯 配 修 復 蛋 白 MLH1，PMS2，MSH2及MSH6表達異常。有研究表明P16蛋白表達與結直腸癌的發生發展密切相關[8－13]，P16蛋白表達是結直腸癌患者診斷及預后的候選標志物。以免疫組化的檢查方法檢查結直腸癌中錯配修復蛋白 MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6以及 P16蛋白的表達情況，并結合統計學分析，分析其在結直腸癌的表達情況。

1 材料和方法

1．1 病例資料 收集本院2016年1月至2017年10月間原發于結直腸腺癌共60例。其中男性35例，女性25例，年齡28～79歲，平均年齡50歲。腫瘤平均最大徑4．6cm，31例呈浸潤潰瘍型，20例呈隆起菜花型，5例呈平坦型，4例呈淺表潰瘍型。腫物切面呈實性，灰白灰紅色，質中偏硬，灶性區域伴出血壞死。

1．2 實驗材料 免疫組化SP法檢測試劑盒及DAB顯色劑均購自福建邁新生物技術有限公司。

1．3 免疫組織化學方法 免疫組織化學試劑一抗福建邁新生物技術有限公司生產的MLH1，PMS2，MSH2及MSH6多克隆抗體。檢測系統采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。石蠟切片厚3微米，60度烤箱烤片1h，二甲苯脫蠟，乙醇水化，浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min，PBS液沖洗，高壓鍋修復，并自然冷卻。二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育 20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑 B，孵育 30min，PBS沖洗 3次，每次5min。控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染，鹽酸酒精分化，返藍、脫水、透明、中性樹膠封片，并做陽性對照和陰性對照。

1．4 免疫組織化學判斷的標準 定位準確，呈棕黃色顆粒為陽性，I陽性定位于細胞漿/膜或細胞核，陽性細胞小于10%為 （－），陽性細胞11－25%為（+），陽性細胞 26－50%為（++），陽性細胞 51－75%為（+++），陽性細胞 76－100%為（++++）。

1．5 統計分析方法 實驗數據采用SPSS 17．0統計軟件進行處理，P＜0．05為差別有統計學意義。

2 實驗結果

2．1 免疫組織化學方法檢測結直腸腺癌中MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6蛋白的表達情況：MMR蛋白的表達缺失率分別為：MLH1缺失率 28．5%，PMS2 缺 失率 25．2%，MSH2 缺 失 率 27．2%，MSH6缺失率27．3%；正常組織中的缺失率分別為：MLH1缺失率 2．5%，PMS2 缺 失 率 3．2%，MSH2 缺 失 率2．2%，MSH6 缺失率 1．9%。 差別具有統計學意義(P＜0．05)，腫瘤組織中MMR蛋白的表達缺失率表達遠高于正常組織。見圖1。

2．2 免疫組織化學方法檢測結直腸腺癌中P16蛋白的表達情況：P16蛋白在結直腸腺癌的表達率為78．3%（47/60）。 高、中分化腺癌中 P16蛋白的表達率為88．3%(53/60），低分化腺癌中P16蛋白的表達率為 15%（9/60）， 差別具有統計學意義 (P＜0．05)，高、中分化腺癌中P16蛋白表達遠高于低分化腺癌。見圖2。

圖1 MLH1蛋白免疫組織化學結果（×400）

圖2 P16蛋白免疫組織化學結果（×200）

3 討論

結直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國男、女性惡性腫瘤發病率排名中分別列第三位、第二位[1－3]，嚴重危害人類健康。研究結直腸癌發生、發展的分子遺傳學機制，尋找和利用有效的早期診斷、分期、分型以及預后的分子生物學標志物，提高結直腸癌的預防、診斷和治療水平，對降低結直腸癌的發病率和死亡率有著重要的意義。

近年來，結直腸癌的發病率逐年上升，其中有部分結直腸癌是由于錯配修復基因突變型失活或錯配修復基因甲基化失活[4－7]，導致微衛星不穩定，從而導致錯配修復蛋白 MLH1，PMS2，MSH2及MSH6表達異常。有研究表明P16蛋白表達與結直腸癌的發生發展密切相關[8－15]，P16蛋白表達是結直腸癌患者診斷及預后的候選標志物。本研究以免疫組化的檢查方法檢查結直腸癌中錯配修復蛋白 MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6以及 P16蛋白的表達情況，我們的研究發現在結直腸癌中，MMR基因缺失是導致 MLH1，PMS2，MSH2和 MSH6蛋白表達率降低。高、中分化腺癌中P16蛋白表達遠高于低分化腺癌，提示P16蛋白可能與結直腸癌的高侵襲性有關。