榛屬ycf1基因生物信息學分析

衛永樂，溫志芳，劉 芳，張杰偉，黃武剛，蘭彥平，程麗莉，曹慶昌，胡廣隆

（1.運城農業職業技術學院，山西 運城 044000；2.北京市農林科學院，北京 100093）

葉綠體在植物細胞中具有與光合作用密切相關的一整套基因。鑒于葉綠體基因組的大小、結構和基因型相對保守性，其已成為植物系統發育研究和識別物種的有力工具[1]。目前，某些葉綠體基因的功能已被研究，但有相當一部分基因是未知的，例如一大類基因，即開放閱讀框（ORF）。它的DNA序列所編碼的特定蛋白質名稱和功能仍在摸索中。由于ORF命名方法有諸多不妥，因此，學術界提出了一種新的YCF（假設葉綠體開放閱讀框）命名方法。例如，小麥的ORF38與菠菜ORF33的氨基酸序列相似性很高，因此都命名為ycf8基因[2]。

葉綠體DNA（cpDNA）序列已被分類學家廣泛用于重建植物系統發育[3]，然而，相對較少的葉綠體基因組區域被用于系統發育研究[4-5]。蛋白質編碼基因容易比對，但通常更加保守，缺乏足夠的變異來解決種間和種內關系[6-7]。比較基因組的研究表明，葉綠體體基因 ycf1，（hypothetical chloroplast open reading frame 1）可以比matK基因變異度更高[8]。ycf1是葉綠體基因組中第二長的基因（僅次于ycf2），并存在于迄今測序的幾乎所有植物葉綠體基因組中[9]。YCF1蛋白的功能是未知的。盡管如此，DRESCHER等[10]研究已經證明，YCF1對植物生存至關重要。ycf1閱讀框通?？缭降怪弥貜蛥^（IR）和小單拷貝（SSC）區域的邊界，這在葉綠體基因中是比較特殊的[9]。ycf1基因在系統發育研究中的效用最近才開始探索。NEUBIG等[11]研究表明，ycf1因為其保守的閱讀框，是相對容易擴增和比對的。此外，在蘭花分類學研究中，ycf1具有類似或僅低于細胞核核糖體DNA內轉錄間隔區（ITS）的高度變異性，比matK有更優異的分辨率。

榛屬植物約有20種，分布在北美洲、歐洲和亞洲；其中，我國有7種及3個變種，主要在東北、華北、西北和西南地區[12]。該屬植物的種子含油量大，在東北、華北地區當作油料；堅果可食用，為北方地區常見干果。喬木樹種木質硬，用于家具制作及建筑業。二代測序技術的應用加快了榛屬葉綠體全基因組研究，榛屬葉綠體全基因組的發表[13]為榛屬植物葉綠體基因奠定了生物信息學分析與鑒定的基礎。

本研究充分利用榛子葉綠體基因組數據庫，以榛屬ycf1基因家族成員為研究對象，著重分析其基因結構、跨膜區的結構特征和編碼區的保守結構域，并與擬南芥及相鄰的鐵木屬經過多重序列比對進行進化和分類分析，旨在為克隆榛子ycf1基因及進一步探索YCF1蛋白的功能奠定堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1 榛屬ycf1基因組、cDNA和蛋白序列的來源

榛屬、鐵木屬及擬南芥的ycf1基因及蛋白序列分別下載自 NCBI網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）和 TAIR 數據庫（http://www.arabidopsis.org）。利用NCBI的Blast P檢索及CDS軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）預測所選蛋白有無YCF1結構域，判斷其是否屬于該基因家族。

1.2 榛屬ycf1基因家族結構分析

利用數據庫，獲取榛屬中ycf1基因家族成員的基因注釋。

1.3 榛屬ycf1基因家族二級結構及跨膜區結構的預測

ycf1基因家族各成員所編碼蛋白質氨基酸的相似性分析[14]、α-螺旋、β-折疊及無規則卷曲等二級結構分析[15]、跨膜區結構[16]分析等分別采用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）和 TMHMMServer v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）等軟件。

1.4 榛屬ycf1基因家族的保守結構域分析

利用軟件 MEME（http：//meme-suite.org/）分析擬南芥、鐵木屬和榛屬ycf1基因蛋白的保守結構域[17]。

1.5 榛屬ycf1基因蛋白三級結構的預測

榛屬和鐵木屬YCF1蛋白質空間結構模型的同源建模[18]由三級結構預測軟件 Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/）的自動建模功能完成。

1.6 榛屬ycf1基因蛋白系統進化樹的構建

擬南芥、鐵木屬和榛屬的ycf1基因蛋白序列的比對利用Clustal X（2.0）[19]軟件進行；將比對結果用MEGA 6.0[20]軟件采用Neighborjoining法（bootstrap值設定為1 000）產生系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 榛屬ycf1基因家族成員的評價

利用NCBI數據庫提供的Blast程序進行Blast P檢索（圖1），得到3個榛屬ycf1基因和1個鐵木屬ycf1基因。用保守域預測軟件CDS驗證了ycf1基因保守結構域的存在，初步確定榛屬中3個ycf1基因分別來自華榛、平榛、歐榛；另外，在同科相鄰的鐵木屬的天目鐵木中也確定了1個ycf1基因作為對比研究基因，即：YP009331532.1（華榛），AOZ20414.2（歐榛），YP009318292.1（平榛），YP009179114.1（天目鐵木）。這幾個基因均沒有內含子。

2.2 榛屬ycf1基因家族的結構分析

表1 YCF1蛋白氨基酸相似性分析%

ycf1基因家族各成員編碼蛋白質氨基酸的相似性分析結果表明，歐榛YCF1蛋白和華榛YCF1蛋白之間的相似性最高，達99.74%；歐榛YCF1蛋白和天目鐵木YCF1蛋白之間的相似性最低，為97.00%（表1）。二級結構預測分析結果表明，榛屬YCF1蛋白中 α-螺旋的比例最高（34.90%～35.89%），其次為無規則卷曲（29.91%～30.25%），再次為β-折疊（25.29%～26.15%），β-轉角最低（8.73%～9.04%）（表2）。榛屬YCF1蛋白的跨膜區結構分析結果表明，榛屬及鐵木屬YCF1蛋白均含有跨膜區（圖2）。

表2 榛屬及天目鐵木YCF1蛋白的二級結構信息 %

利用保守結構域預測軟件MEME分析了擬南芥、鐵木屬和榛屬ycf1基因家族的保守結構域，結果顯示，擬南芥、榛屬和鐵木屬ycf1基因家族包含3個保守結構域。其中，基序1的相似度為2.0e-625；基序2和基序3的相似度分別為3.7e-276和4.5e-343（圖3）。除了擬南芥ycf1基因At1YCF1，無論在樺木科的榛屬和鐵木屬中，還是在十字花科的擬南芥中，ycf1基因家族均含有3個結構域（圖3）。

本研究通過Swiss-Model對榛屬及鐵木屬YCF1蛋白進行同源建模，只發現有5%的序列能與已知模板匹配，即只與轉運蛋白AcrB的一個亞基同源。從圖4可以看出，Swiss-Model預測的榛屬及鐵木屬YCF1蛋白亞基三級結構的空間結構非常相似，暗示不同樺木科YCF1蛋白在生物學功能上存在相似性。

2.3 榛屬YCF1家族蛋白質相似性和系統進化樹分析

利用軟件MEGA 6.0對8個擬南芥YCF1蛋白、4個榛屬及鐵木屬YCF1蛋白的序列進行系統進化樹分析，結果表明，這12個YCF1蛋白序列基本按照物種聚類。YCF1蛋白系統進化樹大致上按照科別進行聚類，推測YCF1蛋白在樺木科和十字花科中生物學功能不盡相同。華榛YCF1（YP009331532.1）與歐榛 YCF1（AOZ20414.2）聚類在一起，暗示華榛YCF1可能具有與歐榛YCF1相似的進化過程和生物學功能（圖4）。YCF1蛋白在樺木科的進化并沒有完全按照屬聚類在一起，相對于平榛，天目鐵木的YCF1蛋白與歐榛及華榛的關系更近（圖 5）。

3 討論

YCF1具體編碼的蛋白質名稱和功能仍在探索中。作為葉綠體基因組中2個最大的開放閱讀框架之一，ycf1常被認為是失去功能的假基因[21-23]。然而，YCF1的敲除試驗顯示，YCF1是細胞存活所必需的[24]。楊小飛等[25]研究發現，核基因組編碼的RNA結合蛋白PBR1，通過調控擬南芥YCF1在葉綠體中的翻譯效率，進而調節3個光合作用復合體的協同生成及穩定性的維持。目前，榛屬ycf1基因家族具體功能尚未鑒定。本研究通過生物信息學鑒定榛屬ycf1基因家族3個基因均含有跨膜區，均含有3個結構域，表明榛屬中不同種間ycf1基因家族中重要結構域存在高度保守性。另外，除了擬南芥ycf1基因編碼蛋白At1YCF1，無論在樺木科的榛屬和鐵木屬中,還是在十字花科的擬南芥中,ycf1基因家族均含有3個結構域。推測YCF1的3個結構域在植物諸多生理過程中發揮相似的作用。

進化分析結果表明，華榛YCF1（YP009331532.1）與歐榛YCF1（AOZ20414.2）聚類在一起，暗示他們可能具有相似的進化過程和生物學功能；YCF1蛋白在樺木科的進化并沒有完全按照屬聚類在一起，相對于平榛，天目鐵木的YCF1蛋白與歐榛及華榛的關系更近。基因的進化并非完全與種屬分類進化一致，同樣的情況出現在蘭花磷酸肌醇特異性磷脂酶C基因家族的進化中[26]。由此可見，榛屬YCF1各成員的生物學功能還需要進一步分析研究。

4 結論

榛屬植物葉綠體基因組中ycf1家族基因，均不含有內含子。榛屬YCF1蛋白均含跨膜區和3個高度保守結構域。進化分析結果表明，華榛ycf1與歐榛ycf1可能具有相似的進化過程和生物學功能。