金絲桃苷抗抑郁作用參與5-HT能系統可能機制研究

鄭梅竹，范亞軍，潘 炎，時東方，劉春明

(1.長春師范大學中心實驗室,吉林長春 130032；2.長春師范大學生命科學學院，吉林長春 130032；3.長春師范大學高等教育研究所，吉林長春 130032)

抑郁癥是一種以心情低落、食欲不振嚴重時會產生自殺念頭為顯著特征的神經退行性疾病，嚴重危害現代社會人類的身心健康[1]。目前，對抑郁癥的相關研究開展較多，但其確切的發病機制尚未明確。在已報道的眾多發病機制中，去甲腎上腺素(NE)、5-羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)單胺神經遞質與抑郁癥的發病機理最為大眾認可和接受。而單胺能系統在中樞神經中擔任重要角色。尤其是5-HT能系統在抑郁癥的治療中占據重要地位。經典的抗抑郁藥物鹽酸氟西汀(百解憂)是基于顯著提高人體內5-HT的含量發揮作用。目前，新的治療抑郁癥藥物不斷涌現，但由于其存在抗抑郁作用比較狹窄、且具有耐藥性、同時因其毒副作用較大、用藥后不良反應極其明顯等缺點嚴重制約了在臨床上的廣泛使用，因此開發新型具有寬抗抑郁、高效低毒的抗抑郁藥物成為研究的重要熱點。而天然藥物由于其來自自然且毒副作用小、有廣闊的應用前景，越來越受到醫務工作者和科研工作者的推崇[2]。

黃酮類化合物廣泛存在于天然藥用植物、水果和蔬菜中，具有利尿、清熱、平肝和安神的功效，有研究表明在抗氧化、抗高血壓和抗腫瘤方面具有明顯的藥理作用[3]，近年來，陸續報道了黃酮類化合物的抗抑郁作用[4-5]。而金絲桃苷是從黃酮類化合物中分離出來的單體成分，且含量較高，前期結果表明金絲桃苷具有明確的抗抑郁活性[6]，但其作用機制尚不明確。本研究在采用小鼠強迫游泳、小鼠懸尾和自主實驗對金絲桃苷的抗抑郁活性進行進一步驗證的基礎上，選用5-HT相關受體(5-HT1A、5-HT2、5-HT2A)及其阻斷劑Way100635、賽庚啶、酮舍林，深入研究金絲桃苷參與抗抑郁活性的5-HT能神經系統的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

金絲桃苷，購自上海源葉生物科技有限公司，純度在99.9%以上；生理鹽水，購自吉林大藥房，批號：20150215。鹽酸氟西汀膠囊，上海中西制藥有限公司，批號：100102。受體阻斷劑Way100635、cyproheptadine、ketanserin均購自美國sigma公司；DMSO，長春鼎國生物公司。

1.2 實驗動物

體重18～22g雄性ICR小鼠,購自吉林長春生物制品研究所實驗動物中心。動物在正常的12h光照,12h黑暗時間表下活動。環境溫度和相對濕度分別保持在22±1℃和55±5%。

1.3 實驗儀器

多功能細胞讀板器(MD,Sunnyvale,CA.USA)。

1.4 實驗方法

1.4.1 動物分組和給藥方法

五組實驗小鼠，每組10只，設為對照組(生理鹽水組)，陽性對照組(鹽酸氟西汀膠囊，5mg/kg)，3個金絲桃苷給藥處理組(給藥濃度分別為10、20、30mg/kg)，所有藥物通過灌胃以20mL/kg體重的劑量使用，1次/天，持續10天。最后一次給藥1h后，開始進行動物行為學的檢測。

1.4.2 小鼠強迫游泳試驗

小鼠強迫游泳實驗根據Porsolt建立的方法[7]進行檢測。小鼠單獨在開放的圓柱形容器(直徑10cm，高25cm)中強迫游泳，該容器水溫25±1℃，水深19cm，每只動物在6分鐘的過程中保持不動的總時間被記錄為不動時間(以秒為單位)。每只小鼠在停止掙扎時被判定為不動，并且在水中保持懸浮不動，只做出必要的動作以保持頭部高于水面。不動時間的減少表明具有抗抑郁作用。

1.4.3 小鼠懸尾試驗

尾部懸浮試驗(TST)根據Steru等建立的方法[8]進行檢測。使用懸尾夾子，在距離盒子(250mm×250mm×300mm)尾部10mm，頭部距離底部5cm處將小鼠分別懸掛在尾部。在具有最小背景的黑暗房間中測試噪聲，每只小鼠懸掛6分鐘，在最后4分鐘間隔記錄不動時間。判定標準是小鼠停止掙扎，完全靜止不動。

1.4.4 小鼠自主運動實驗

為了評估金絲桃苷對小鼠運動行為的影響，將小鼠單獨放置在暗室的矩形容器(40cm×40cm×25cm)中，配備有攝像機，自動記錄小鼠在5min中內的自主活動情況。每個腔室的地板表面用70%乙醇徹底清潔。

1.4.5 金絲桃苷對給予5-HT相關受體阻斷劑小鼠懸尾實驗的影響

取健康小鼠40只，隨機分為4組：生理鹽水對照組，Way100635 0.1mg/kg組/cyproheptadine 5mg/kg組/ketanserin 3mg/kg組，金絲桃苷20mg/kg給藥組，金絲桃苷20mg/kg+Way100635 0.1mg/kg組/cyproheptadine 5mg/kg組/ketanserin 3mg/kg組。灌胃給藥，每天一次，持續十天，末次給藥1h后，除生理鹽水對照組、金絲桃苷20mg/kg給藥組外，其余各組均皮下注射Way100635 0.1mg/kg/cyproheptadine 5mg/kg/ketanserin 3mg/kg，而對照組經皮下注射同等體積10mL/kg的生理鹽水，30min后分別將小鼠尾部2cm處的部分固定于懸尾支架上，使小鼠呈倒掛狀態，其頭部離臺面約5cm，每只動物兩側用板隔開，遮擋動物視線，使之互不干擾。適應1min，觀察記錄5min持續累計不動時間。

1.4.6 數據處理

所有數據以X±SD表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 金絲桃苷對小鼠強迫游泳行為的影響

金絲桃苷對小鼠強迫游泳行為影響實驗表明陽性對照藥鹽酸氟西汀、金絲桃苷10mg/kg、20mg/kg給藥組均能明顯縮短小鼠強迫游泳累積不動時間(P<0.05)(表1)。

表1 金絲桃苷對小鼠強迫游泳行為的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 金絲桃苷對小鼠懸尾行為的影響

與對照組相比金絲桃苷10mg/kg、20mg/kg給藥組能明顯縮短懸尾小鼠的累計不動時間(P<0.05)，尤其是20mg/kg給藥組與陽性對照組效果幾乎一致(表2)。

表2 金絲桃苷對小鼠懸尾行為的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 金絲桃苷對小鼠自主運動行為的影響

金絲桃苷各給藥組小鼠的自主運動情況與陽性對照和空白之間沒有顯著差異。結果表明在實驗所使用的金絲桃苷抗抑郁劑量范圍內沒有明顯的中樞興奮或抑制作用(P>0.05)(表3)。

表3 金絲桃苷對小鼠自主運動行為的影響

2.4 5-HT1A受體阻斷劑對金絲桃苷作用的影響

金絲桃苷給藥組能明顯縮短懸尾小鼠累計不動時間，與對照組差異顯著(P<0.05)；但是金絲桃苷與5-HT1A受體阻斷劑Way100635聯合給藥后對懸尾小鼠累計不動時間無明顯的延長，與Way100635組和金絲桃苷組相比差異均不顯著(P>0.05)(表4)。

表4 金絲桃苷對給予5-HT1A受體阻斷劑Way100635小鼠懸尾試驗的影響

注：與照組比，*P<0.05；與Way100635比，﹟﹟P<0.01。

2.5 5-HT2A受體阻斷劑對金絲桃苷作用的影響

金絲桃苷給藥組能明顯縮短懸尾小鼠累計不動時間,與對照差異顯著(P<0.05)；但是金絲桃苷與5-HT2A受體阻斷劑cyproheptadine同時給藥明顯延長懸尾小鼠累計不動時間，與cyproheptadine組和金絲桃苷組相比差異顯著(P<0.01)(表5)。

表5 金絲桃苷給予5-HT2A受體阻斷劑Cyproheptadine小鼠懸尾試驗的影響

注：與照組比：*P<0.05;與Cyproheptadine，##P<0.01;與金絲桃苷比，△△P<0.01。

2.6 5-HT2受體阻斷劑對金絲桃苷作用的影響

金絲桃苷給藥組能明顯縮短懸尾小鼠累計不動時間,與對照組差異顯著(P<0.05)；而金絲桃苷與5-HT2受體阻斷劑ketanserin同時給藥明顯延長懸尾小鼠累計不動時間，與ketanserin組和金絲桃苷組相比差異顯著(P<0.01)(表6)。

表6 金絲桃苷對給予5-HT2受體阻斷劑ketanserin小鼠懸尾試驗的影響

注：與照組比,*P<0.05；與ketanserin比,##P<0.01；與金絲桃苷比,△△P<0.01。

3 討論

小鼠強迫游泳和小鼠懸尾是較為常用的、經典的抑郁癥動物模型。模型所體現出的小鼠絕望、行為扭曲等狀態是體外模擬抑郁癥的顯著特征，同時由于其對抗抑郁藥物比較敏感且便于操作，因此是抗抑郁藥物常用的篩選模型[9]。本研究采用這兩種經典的抑郁動物模型對金絲桃苷的抗抑郁活性進行進一步的評價與驗證。結果表明，金絲桃苷能顯著縮短小鼠強迫游泳和小鼠懸尾的累積不動時間，同時對小鼠的自主活動沒有明顯的影響，表明金絲桃苷具有明確的抗抑郁作用。

抑郁癥的發病機制比較復雜，包括受體假說、細胞因子假說、單胺假說等。其中單胺假說認為抑郁癥的發病與神經遞質水平的下降密切相關是最為大家廣泛認可接受的。而單胺系統中5-羥色胺在突出間隙的缺乏或者水平持續下降在抑郁癥的發病進程中起著重要作用[6]。5-HT能與其它的神經中樞相互傳導，同時參與中樞神經對外部環境刺激所引起的適應性反應。Amat等[10]研究發現，在發生應激事件時大鼠中縫核的5-HT能神經元的活性被激活并大幅度的提升。Henn等[11]研究發現對于長期隔離飼養的大鼠，由于環境隔絕導致情緒低落，發現其海馬內5-羥色胺能的釋放量明顯減少。Ruhé[12]等研究發現對于嚴重的抑郁癥患者，在長期服藥偶然停藥后，會導致情緒低落，這與患者體內5-HT的缺失或其水平的急劇降低有密切關系。本研究結果證實金絲桃苷具有明確的抗抑郁活性，其作用機理與5-羥色胺能系統(5-HT2A、5-HT2受體系統)有確切的關系。金絲桃苷抗抑郁活性作用的發揮與其它神經遞質是否存在密切的關系，需要進一步的深入探討。