SIRT1通過降低NF-kB p65表達減輕異煙肼致人肝細胞損傷的研究*

[華北理工大學公共衛生學院(河北省煤礦衛生與安全重點實驗室)，河北 唐山 063000]

異煙肼(Isoniazid,INH)是抗結核治療的一線藥物，其主要副作用是抗結核藥物性肝損傷(antituberculosis drug-induced liver injury,ADLI)[1]。目前認為異煙肼藥物代謝引起的炎癥反應在肝損傷發生過程中起重要作用，并可能成為ADLI防治的重要靶點[2]。

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)作為催化核心組蛋白和非組蛋白發生去乙酰化作用的重要酶類物質，在調控細胞生長、參與氧化應激反應及炎癥基因表達等方面發揮著重要功能[3-4]。沉默信息調節因子1(SIRT1)是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴性的Ⅲ型組蛋白去乙酰化酶，與細胞衰老、抗氧化應激以及抑制炎癥等細胞多種功能活動有關[5]。近年來有研究表明，轉化生長因子1(TGF-β1)在腎小球系膜細胞中發揮作用的過程中，沉默SIRT1可使TGF-β1誘導的纖維連接蛋白、Ⅰ型膠原和細胞外基質的表達及Smad3的乙酰化水平增加；加入白藜蘆醇能夠激活SIRT1，使其與Smad3結合而增加Smad3的去乙酰化水平，進而抑制Smad3表達，減輕腎臟纖維化的發生[6]。另外，NF-kB是SIRT1的靶分子，故推測在異煙肼致肝損傷過程中由NF-kB介導的促炎癥反應增強也可能與SIRT1的表達變化有關。

本研究通過異煙肼刺激人正常肝細胞，觀察在異煙肼致肝細胞損傷過程中SIRT1的表達變化，并通過加入SIRT1的激動劑和抑制劑影響SIRT1表達，觀察其對炎癥因子的影響，從而探討SIRT1在異煙肼致人肝細胞損傷中的調控作用，為ADLI的預防和結核病患者的高效保肝治療研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人正常肝細胞株HL-7702引自上海中科院細胞所，異煙肼(批號:YSMXE-OM)、二甲基亞砜(批號:W3OKK-MI)購自日本TCI公司，青霉素與鏈霉素(批號:1634678)購自德國BI公司，0.25%胰蛋白酶(批號:25200-072)購自美國Gibco公司，SIRT1激動劑SRT1720(批號:S112906)、抑制劑EX527(批號:S154103)購自美國Selleck公司，Prime ScriptTMRT Master Mix試劑盒(批號:AK4601)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒(批號:AK4602)購自大連寶生物工程有限公司，TRI pure Reagent 總RNA抽提試劑盒(批號:0020161010)購自北京百泰克生物技術有限公司，ALT、AST試劑盒(批號:20170301)購自南京建成生物工程研究所，SIRT1、NF-kB p65、TNF-α ELISA檢測試劑盒(批號:201612)購自北京冬歌偉業生物技術有限公司，IL-6 ELISA檢測試劑盒(批號:210660124)購自杭州聯科生物技術有限公司，Heraeus高速冷凍離心機購自德國Thermo Scientific公司，CA94089型連續光譜酶標儀購自美國Molecular Devices公司，C1000PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRTPCR)儀購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 細胞培養

用含90% RPMI 1640(批號:24916002，美國CORNING公司)、10%胎牛血清(批號:JC50166，美國CLARK公司)、1%雙抗的培養液作為HL-7702細胞的培養基，將細胞放置于濃度為5%的二氧化碳、37oC的細胞培養箱中進行培養。取對數生長期細胞，調整細胞濃度為1×105個/ml，接種到6孔板上，每孔為2 ml。接種預培養24 h后更換培養基并給予相應處理，再次培養48 h后分別收集細胞及上清液。

1.3 細胞分組及干預

實驗按以下分組處理:空白對照組(1640培養基)、異煙肼組(含800 μg /ml異煙肼的1640培養基，INH)、異煙肼+SIRT1激動劑組(含800 μg/ml異煙肼和1 μmol /L SIRT1激動劑SRT1 720的1640培養基，INH+SRT1 720)、SIRT1激動劑對照組(含1 μmol/L SIRT1激動劑SRT1 720的1640培養基，SRT1 720)、異煙肼+SIRT1抑制劑組(含800 μg/ml異煙肼和1 μmol/L SIRT1抑制劑EX527的1640培養基，INH+EX527)、SIRT1抑制劑對照組(含1 μmol/L SIRT1抑制劑EX527的1640培養基，EX527)。

1.4 細胞上清液中ALT、AST含量檢測

收集細胞培養的上清液，嚴格按照商品化的丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒說明書進行操作，測定各指標含量。

1.5 肝細胞中SIRT1、NF-kB p65 mRNA表達水平的檢測

采用qRT-PCR方法檢測肝細胞中SIRT1、NF-kB p65 mRNA表達水平。收集細胞用Trizol提取RNA，檢測并計算RNA的純度和濃度；取RNA在逆轉錄酶的作用下合成cDNA。利用SYBR Green嵌合熒光法進行實時PCR擴增。逆轉錄、qRT-PCR技術嚴格參照試劑盒說明書進行操作。逆轉錄條件為37oC 15 min，85oC 5 s，4oC 1 min。mRNA表達水平的檢測以GAPDH為內參，反應條件:95oC 30 s，95oC 5 s，60oC 30 s共40個循環，熒光引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司負責設計與合成。引物序列如下:GAPDH正向引物5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，反向引物5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3'；SIRT1正向引物5'-CATAGACACGCTGGAACAGG-3'，反向引物5'-TTGAGGGAAGACCCAATAACA-3'；NF-kB p65正向引物5'-GCGAGAGGAGCACAGATAC C-3'，反向引物5'-GCACAGCATTCAGGTCGTAG-3'。采用2-ΔΔCt計算mRNA表達水平。

1.6 肝細胞中SIRT1、NF-kB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達水平的檢測

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測肝細胞中SIRT1、NF-kB p65、IL-6、TNF-α蛋白表達水平，嚴格參照試劑盒的說明書進行操作。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析比較各組間的差異，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞上清液中ALT和AST含量的比較

異煙肼誘導引起HL-7702細胞上清液ALT、AST含量增加，與空白對照組比較差異有統計學意義(q=22.490和17.330，均P=0.000)，表明異煙肼組肝細胞發生損傷。SIRT1激動劑對照組和抑制劑對照組與空白對照組差異無統計學意義(P＞0.05)，提示激動劑和抑制劑對培養的人肝細胞無毒作用。異煙肼組之間比較，異煙肼+SIRT1激動劑組ALT、AST含量降低，異煙肼+SIRT1抑制劑組則進一步升高，差異有統計學意義(q=9.951、20.234、12.908和16.741，均P=0.000)，表明SIRT1激動劑的加入減輕異煙肼引起的肝細胞損傷而SIRT1抑制劑的加入進一步加重了肝細胞損傷的發生。見附表。

附表 各組細胞上清液中ALT和AST含量的比較(u/L，±s)

附表 各組細胞上清液中ALT和AST含量的比較(u/L，±s)

注:1)與空白對照組比較，P ＜0.05；2)與異煙肼組比較，P ＜0.05

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2.2 激動劑SRT1720對SIRT1的激動作用

異煙肼刺激造成HL-7702細胞的SIRT1 mRNA和蛋白表達降低，NF-kB p65的mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6的蛋白表達升高，與空白對照組比較差異有統計學意義(q=2.564、15.132、5.582、11.431、14.816和16.318，P=0.019、0.000、0.002、0.000、0.000和0.000)，提示異煙肼組細胞發生了炎癥反應。激動劑對照組與空白對照組炎癥因子表達的差異無統計學意義(P＞0.05)，提示激動劑對細胞無毒作用。SIRT1激動劑SRT1720的聯用可以抑制異煙肼刺激引起的NF-kB p65 mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6蛋白表達上升，與異煙肼組比較差異有統計學意義(q=2.849、7.581、9.081和16.528，P=0.012、0.000、0.000和0.000)，提示SIRT1的激活可以通過降低NF-kB p65表達進而減少IL-6、TNF-α表達，減輕異煙肼引起的炎癥反應。見圖1～3。

2.3 抑制劑EX527對SIRT1的抑制作用

SIRT1抑制劑EX527的聯用可引起NF-kB p65 mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6蛋白表達進一步上升，與異煙肼組比較差異有統計學意義(q=2.736、8.142、8.917和18.454，P=0.015、0.000、0.000和0.000)，說明SIRT1的抑制可以通過增加NF-kB p65表達進而使TNF-α、IL-6表達上升，加重異煙肼導致的炎癥反應。抑制劑對照組與空白對照組炎癥因子表達的差異無統計學意義(P＞0.05)，提示抑制劑對細胞無毒作用。見圖4～6。

圖1 各組SIRT1、NF-kB p65的mRNA表達

圖2 各組SIRT1、NF-kB p65的蛋白表達

圖3 各組IL-6、TNF-α的蛋白表達

圖4 各組SIRT1、NF-kB p65的mRNA表達

圖5 各組SIRT1、NF-kB p65的蛋白表達

圖6 各組IL-6、TNF-α的蛋白表達

3 討論

隨著抗結核藥物性肝損傷研究的深入，越來越多的研究發現藥物代謝引起的炎癥反應在其發生發展過程中起著重要作用，但由于其機制十分復雜，目前為止尚不明確其損傷作用。NF-kB是1個蛋白二聚體，由p50、p65 兩種蛋白亞基組成，它存在于多種細胞中且是細胞中多條信號通路的匯集點，并在炎癥的發生、發展中具有至關重要的作用[7]。研究表明，NF-kB的高表達與肝臟疾病的發病密切相關:在運用活性氧誘導肝細胞癌的過程中會使NF-kB表達增加，而刺激活性氧增加會使NF-kB表達進一步增加，從而促進肝細胞癌的發生，這提示在肝癌發生的過程中，NF-kB可能起著重要作用[8]；此外，使用抗炎藥物治療膽汁淤積性肝損傷的大鼠，NF-kB水平會隨著治療時間延長而明顯下降，這同樣表明其與肝臟疾病的關系十分密切[9]。課題組前期研究發現，異煙肼致小鼠肝損傷發生過程中，NF-kB通路被激活，促炎因子TNF-α過量產生[10]。本研究結果顯示，異煙肼引起的肝細胞損傷中NF-kB p65的表達升高，炎癥因子IL-6、TNF-α也隨之表達上升，進一步提示藥物代謝引起的炎癥反應在ADLI發生過程中的重要作用。

SIRT1作為一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙酰化酶，能夠調控多種蛋白質發生去乙酰化，從而參與到基因表達調控及機體免疫炎癥反應等許多生物學功能的調控過程中。例如應用丹酚酸B上調SIRT1表達，使p53去乙酰化水平增加，進而抗氧化酶活性提高，致乙醇誘導的急性肝損傷程度減輕[11]。另有研究發現，在代謝相關的肝癌小鼠模型中，上調SIRT1表達，肝癌的發生率可明顯降低，并且SIRT1表達升高后，也會明顯降低肝臟的高脂損傷[12]。本研究結果顯示SIRT1在異煙肼致人正常肝細胞損傷的過程中呈低表達狀態，提示其可能參與到異煙肼致人正常肝細胞損傷的過程中。

研究證實SIRT1可以通過調控炎癥因子的表達情況，進而參與到機體免疫系統調節腫瘤發生和發展的過程中[13-14]。SIRT1抑制炎癥反應的相關機制目前并不十分清楚，但大多數觀點認為它與抑制炎癥信號通路有關。其中，研究最多的是SIRT1對NF-kB信號通路的抑制作用。早有研究指出，SIRT1表達水平的異常可以引起NF-kB信號通路的紊亂，進而導致抗炎功能的紊亂[15]。近年來有研究發現，NF-kB p65亞單位自身需要經過一系列的修飾才可發揮它轉錄因子的功能，其中乙酰化修飾是其最重要的修飾途徑之一[16]。有研究證實，SIRT1可使NF-kB的亞基RelA/p65去乙酰化，致NF-kB表達減少，這可能阻止了炎癥反應發生及隨后的心肌重構[17]。WANG等[18]研究發現，SIRT1可以對生物鐘基因Per2啟動子區組蛋白H4K16進行去乙酰化從而抑制其轉錄，且其作用強于對組蛋白H3K9的去乙酰化作用，進而調節生物鐘與機體老齡化的平衡狀態。由此可猜測，在異煙肼致人肝細胞損傷過程中，SIRT1作用于NF-kB p65的機制可能是其使NF-kB p65靶基因啟動子區組蛋白發生去乙酰化，進而抑制基因轉錄，減輕肝損傷的發生，這還有待于進一步研究。

本研究結果表明，與空白對照組比較，異煙肼引起的肝細胞損傷中SIRT1表達減少，NF-kB p65的表達升高。SIRT1激動劑的加入可降低異煙肼誘導的NF-kB p65的表達，減少IL-6、TNF-α等炎癥因子的產生；加入SIRT1抑制劑后，可使NF-kB p65表達進一步升高。以上結果表明，激活SIRT1對異煙肼誘導的肝細胞具有保護作用，它的機制可能是SIRT1通過作用于NF-kB p65，減少NF-kB與核內炎癥基因結合，進而減少IL-6、TNF-a等炎癥因子的產生。

綜上所述，SIRT1在異煙肼藥物的刺激下呈低表達狀態，可能參與到異煙肼致人正常肝細胞損傷的過程中。盡管本研究推測出SIRT1低表達與異煙肼致人正常肝細胞損傷的關系，但是本研究只運用一種正常人肝細胞系HL-7702進行試驗，未考慮到細胞系的多樣性，也不能證實相關機制是否具有普遍性，仍需在其他人正常肝細胞系中進行驗證和比較以及更深層次的體內外和臨床實驗研究來明確兩者的相關機制，為今后的ADLI的預防性治療提供更詳盡的依據。