MMP-9過表達對骨肉瘤143B細胞侵襲與遷移能力的影響

齊巍，李勇，琚紹靜，孫娜，張瑞杰

(1.河北省唐山市第二醫院 創傷一科，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市第二醫院骨病科，河北 唐山 063000；3.華北理工大學基礎醫學院，河北 唐山 063000)

骨肉瘤是多發于青少年的惡性腫瘤，具有惡性程度高、轉移早、轉移率高、侵襲力強等特點，是導致治愈率低的主要原因。細胞外基質和基底膜是惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉移的重要天然組織學屏障[1]。腫瘤細胞可以產生多種蛋白水解酶，降解細胞外基質和基底膜，在癌細胞侵潤和轉移的過程中發揮作用，其中尤以基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP-9)發揮作用最為重要[2]。因此，探討其與腫瘤侵襲、轉移的機制及其關系具有重要的理論和臨床意義。本研究以骨肉瘤143B細胞為研究對象，研究MMP-9過表達對成骨肉瘤143B細胞侵襲與遷移能力的影響，以及探討MMP-9及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等與骨肉瘤的復發與轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人成骨肉瘤143B細胞株由華北理工大學基礎醫學實驗室饋贈，10% FBS、DMEM培養基和qRTPCR反應試劑盒均購置于美國Invitrogen公司,慢病毒過表達及陰性對照載體購置于上海吉凱基因化學技術有限公司，pLV-Puro MMP-9陽性序列:5'-UCCAGGGCGAGGACCAUAGAG-3'、pLV-Puro MMP-9陰性對照序列:5'-ACGUGACACGUUCGGA GAAGTCT-3'、Transwell小室購置于以色列BI公司，MMP-9和VEGF一抗和二抗均購置于北京中杉金橋生物技術有限公司，JSM-6030LV激光共聚焦顯微鏡購置日本電子株式會。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組轉染 骨肉瘤143B細胞用含10%FBS、1%(100μmg/ml青霉素和10μmg/ml鏈霉素)的DMEM完全培養基，并置于37℃、5% 二氧化碳飽和濕度培養箱培養，當細胞生長匯合至80%時可進行消化傳代。取對數生長期細胞，常規消化143B細胞，調整細胞濃度為2×105個/ml，接種于6孔板中，實驗分為3組:轉染組(轉染pLV-Puro MMP-9過表達序列)、對照組(轉染pLV-Puro MMP-9-NC序列)、空白組(PBS)。參照吉凱慢病毒轉染說明書進行操作，48 h后激光共聚焦顯微鏡下觀察轉染率。

1.2.2 qRT-PCR檢測mRNA表達 收集各組細胞，制成單細胞懸液，參照Trizol說明書一步法提取細胞MMP-9和VEGF的總RNA，檢測RNA濃度復合實驗要求后，取2 μl總RNA樣品逆轉錄合成cDNA，再取1 μl cDNA為模板進行PCR擴增反應，MMP-9引物序列正向引物:5'-CTGTTGG ACTGCTGCTTTGCTG-3'；反向引物:5'-GTCTCCTGA AAGGTTTGGAAT-3'。β-actin引物序列正向引物:5'-GTTGGGACCTGAGAGACTA-3'；反向引物:5'-TGGCG ATGTCCAG TCACACT-3'。PCR擴增反應條件:95℃預變性20 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，40個循環后再72℃延伸10 min。采用比較2-△△Ct法對實驗結果進行分析。

1.2.3 Western blot檢測MMP-9和VEGF蛋白表達轉染后48 h收集對數生長期各組細胞，提取各組細胞總蛋白，每組樣品取35 μg蛋白質/泳道，進行SDSPAGE電泳，分別制配5%的濃縮膠和10%的分離膠，設置電壓和電流進行電轉，設置250 mA 90 min將凝膠中蛋白轉移至PVDF膜；分別滴加150 μl一抗MMP-9和VEGF(1:2 000)以及一抗β-actin(1:1 000)，4℃過夜；TBST洗膜，每次10 min×3次；加相應100 μl二抗MMP-9和VEGF (1:1 000)，37℃培養1.5 h；TBST洗膜，每次10 min×3次。進行ECL顯色，掃描儀掃描條帶分析光密度值。

1.2.4 Tanswell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 以預冷空白培養基DMEM按1:8的比例稀釋膠體，取100 μl稀釋液滴加于Transwell小室的上室，置于37℃細胞培養培養基箱1 h即可制成Matrigel膠，常規消化單細胞懸液，調整細胞濃度為2×105個/ml；以100 μl/孔滴加至Transwell小室上層，滴加500 μl(20% FBS)的DMEM至下室，常規培養24 h。吸去小室內液體，使用濕潤棉簽輕拭擦去小室上層的Matrigel膠和未穿透過的細胞，將小室底部的聚碳酸酯膜用刀片切割下來，置于4%多聚甲醛液中，固定30 min以上；PBS沖洗3遍，對酯膜進行蘇木素染色，封片。倒置顯微鏡下隨機選取5個視野計數細胞并拍照，觀察每個視野內穿過脂膜的細胞數量，以穿過脂膜的細胞總數為指標評價細胞的侵襲能力。

1.2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 采用記號筆在6孔板背面畫出均勻間隔0.8 cm左右的橫線，橫穿過孔，每孔至少穿過5條線。各組細胞常規消化制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×106個/ml。細胞生長良好融合率達到80%時用10 μl的槍頭作劃痕，劃痕完畢后，PBS輕輕沖洗3遍，漂洗去除劃下的細胞，繼續培養。按0和24 h時間點取樣，拍照，并測量多個點劃痕寬度，計算平均劃痕愈合率。用Image J軟件分析培養0和24 h時的各組劃痕情況。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 20.0統計軟件，計量資料以均數±標準差(±s)表示，比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒介導細胞轉染率

根據最強紅色熒光判斷轉染率，激光共聚焦顯微鏡觀察轉染效率證實慢病毒介導的轉染方法轉染率高，可達90%以上。見圖1。

圖1 細胞轉染率 (激光共聚焦顯微鏡×400)

2.2 MMP-9和VEGF的mRNA表達情況

實驗組MMP-9和VEGF的mRNA相對表達量均高于對照組和空白組。經統計學分析，實驗組MMP-9和VEGF的mRNA表達量相對于對照組和空白組均增高(P ＜0.05)，而空白組和對照組之間MMP-9和VEGF的mRNA表達量差異無統計學意義(t=20.625和16.472，P =0.165和0.072)。見表1和圖2。

表1 各組MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表達量(n =6，±s)

表1 各組MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表達量(n =6，±s)

注:?與對照組、空白組比較，P ＜0.05

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圖2 各組MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表達量

2.3 MMP-9和VEGF的蛋白表達情況

實驗組MMP-9和VEGF的蛋白相對光密度值均高于空白組和對照組。經統計學分析，實驗組MMP-9和VEGF的蛋白表達量均高于空白組和對照組(P ＜0.05)，而空白組和對照組MMP-9和VEGF的蛋白表達量差異無統計學意義(t=16.206和12.572，P =0.106和0.060)。見表2和圖3。

表2 各組細胞MMP-9、VEGF蛋白的表達(n =6，±s)

表2 各組細胞MMP-9、VEGF蛋白的表達(n =6，±s)

注:?與空白組和對照組比較，P ＜0.05

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2.4 Transwell體外侵襲實驗

圖3 各組蛋白表達水平

圖4 各組細胞的侵襲能力 (蘇木素染色×200)

圖5 各組細胞的遷移情況 (×40)

實驗組穿過人工基底膜細胞數為(92.80±2.65)個/視野，對照組為(56.80±5.37)個/視野，空白組為(54.80±2.90)個/視野(見圖4)。經統計學分析，個/視野，對照組為(56.80±5.37)個/視野，空白組為(54.80±2.90)個/視野(見圖4)。經統計學分析，實驗組穿膜細胞數高于對照組和空白組，差異有統計學意義(F=34.214，P =0.012)，而對照組與空白組比較差異無統計學意義(t=28.057，P =0.086)。說明實驗組細胞的侵襲能力增高。

2.5 細胞的遷移運動能力

實驗組、對照組和空白組劃痕愈合率分別為(68.58±3.48)%、(32.17±3.25)%、(29.13±4.18)%(見圖5)。經統計學分析，各組細胞劃痕愈合率比較，空白組和對照組比較差異無統計學意義(F=9.207，P =0.155)，而實驗組細胞劃痕愈合率高于對照組和空白組(F=13.355，P =0.030)。表明實驗組細胞的遷移速度快于對照組及空白組。

3 討論

骨肉瘤為青少年最常見惡性腫瘤，惡性程度高，具有很高的致殘率和致死率，侵襲性強，轉移率高，預后較差[3]。調查資料顯示，骨肉瘤易于肺部轉移[4]。臨床治療骨肉瘤以手術截肢和輔助放化療為主，患者的生存率無提高[5]。腫瘤轉移早和術后易復發是影響骨肉瘤治療和生存率的重要因素[6]。在監控骨肉瘤轉移復發方面至今為止尚缺乏針對性的預測靶基因和腫瘤標志物，尋找針對骨肉瘤轉移復發的腫瘤標志物對于骨肉瘤的早期診斷、早期治療及預后檢測具有重要的意義，因此，研究骨肉瘤侵襲、轉移及復發相關的作用機制具有重要臨床意義。本研究以骨肉瘤143B為研究對象，試圖探索MMP-9過表達對成骨肉瘤143B細胞侵襲與遷移能力的影響。以及探討MMP-9及VEGF與骨肉瘤的復發與轉移的關系。

基質金屬蛋白酶(MMPs)是鋅離子依賴性蛋白水解酶，能降解細胞外基質的成分，與腫瘤浸潤、轉移、血管形成關系十分密切，細胞外基質間的黏附及細胞外基膜的降解被認為是惡性腫瘤侵襲轉移的首要條件[7]。MMP-9是(MMPs)家族中重要的一員，屬于Ⅳ型膠原酶，MMP-9蛋白酶是降解Ⅳ型膠原最重要的酶，與腫瘤的浸潤、轉移及血管形成能力有關[8-9]，并參與細胞外基質降解和再塑。MMP-9具有降解細胞外基質，破壞細胞的天然屏障的作用，同時具有調控細胞之間、細胞與基質間的黏附作用，促使癌細胞發生浸潤和轉移[10]；并且MMP-9還可以協同纖維蛋白溶解酶和組織蛋白酶等酶類，降解血管周圍基質和血管基底膜[11]。這一過程強化癌細胞的局部侵襲和遠處轉移。李昕等[12]探討MMP在骨肉瘤中的表達及與侵襲轉移的關系，應用免疫組織化學法檢測骨肉瘤MMP-9的表達，并分析其與無瘤生存率和侵襲轉移的關系，發現MMP-9與骨肉瘤細胞的高侵襲轉移能力相關。陳雷等[13]研究骨肉瘤組織中基MMP-9的表達情況，發現MMP-9可作為骨腫瘤惡性表型的標志，可作為骨肉瘤診斷的輔助指標，MMP-9是骨肉瘤細胞侵襲的標志。同樣，LV等[14]在骨肉瘤患者發現，5年內發生肺轉移患者中MMP-9陽性率明顯高于5年內未發生肺轉移患者，表明MMP-9高表達與骨肉瘤的侵襲轉移能力密切相關，MMP-9有可能成為骨肉瘤肺轉移的預測指標。本研究通過慢病毒介導MMP-9過表達轉染人骨肉瘤143B細胞，Transwell體外侵襲實驗結果顯示，實驗組細胞的侵襲能力高于對照組和空白組，MMP-9過表達可促進增加骨肉瘤細胞的侵襲能力。細胞劃痕實驗結果顯示，實驗組細胞劃痕愈合率高于對照組和空白組，實驗組細胞的遷移速度快于對照組及空白組。說明MMP-9過表達促進骨肉瘤143B細胞的侵襲和遷移能力。

VEGF是目前作用最強的一種促進腫瘤血管生長因子，通過與內皮細胞特異性受體結合促進內皮細胞增殖，增加微血管通透性，促進血管形成。同時它可以旁分泌的方式作用于內皮細胞，刺激內皮細胞分泌MMP-9。VEGF與腫瘤生長、浸潤及轉移密切相關。研究發現MMP-9在降解細胞外基質的過程中，能夠釋放出生長因子如b-FGF、TGF-β等，它們能夠上調VEGF的表達[15]。黃自鋒等[16]研究MMP-9、VEGF的表達與骨肉瘤血管新生及臨床復發轉移的關系，結果發現MMP-9、VEGF共同參與骨肉瘤的血管生成并協同表達。李昱等[17]發現分化程度較低、浸潤程度較深、伴淋巴結轉移、臨床分期較高的非小細胞肺癌患者，同時伴有MMP-9與VEGF的高表達，提示MMP-9與VEGF有著內在聯系，MMP-9作用于VEGF因子。本研究以慢病毒介導MMP-9過表達轉染人骨肉瘤143B細胞，qRT-PCR結果發現，實驗組MMP-9和VEGF mRNA的表達量增高，免疫細胞化學染色結果發現，實驗組MMP-9和VEGF蛋白表達量增高，并促進骨肉瘤143B細胞侵襲和轉移。同樣，有研究發現VEGF可通過ETS-1調節MMP-9啟動子從而上調MMP-9 mRNA的表達[18]。POYER等[19]發現MMP-9與VEGF之間相互調節促進對方的分泌，兩者之間存在著正反饋調節作用。

在腫瘤細胞從增殖到局部浸潤和遠處轉移這一過程，蛋白水解酶介導的細胞外基質降解、基底膜降解和腫瘤微血管的形成起到關鍵作用。MMP-9和VEGF在骨肉瘤的的浸潤和轉移過程中起著重要作用，骨肉瘤中MMP-9和VEGF可作為評價骨肉瘤預后指標，目前從臨床研究已初步揭示了MMP-9和VEGF表達水平與骨肉瘤患者預后之間的關系。同時，通過對其調控機制的進一步深入研究，將有助于找到治療骨肉瘤轉移的有效生物靶點，給廣大骨肉瘤患者帶來福音。