小鼠腎發育中Slit2及其受體Robo1的表達*

(錦州醫科大學基礎醫學院，遼寧 錦州 121001)

神經遷移因子(Slit)及其跨膜受體蛋白(Roundabout,Robo)屬于神經導向因子，兩者最初是在果蠅中被檢測到并在其神經系統篩選、克隆成功[1-2]。在哺乳動物中，Slit有3種亞型，Slit1、Slit2及Slit3。Robo有4種亞型，Robo1、Robo2、Robo3及Robo4。其中，Slit2蛋白廣泛表達于神經組織、泌尿系統及呼吸系統[3-4]；Robo1在神經、肺、肝臟、腎臟及心臟中均有表達[5-6]。實驗研究顯示Slit和Robo在神經系統廣泛表達，并參與神經系統的發育過程；在非神經系統如肺、腎臟、心臟、卵巢、血管、性腺及乳腺等多個器官組織的發育過程中同樣發揮重要作用[7-8]。本研究采用免疫組織化學技術和蛋白印跡技術對Slit2及其受體Robo1在小鼠腎發育中的表達進行系統觀察和定量分析，為后續探討其在腎發育中的作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 中國昆明系清潔級小鼠90只[成年小鼠12～22 g，其余各胚(日)齡未測量體重]購自錦州醫科大學實驗動物中心[醫動字第SCXY(遼)2013-2017號]。

1.1.2 實驗試劑 Slit2兔多克隆抗體和Robo1兔多克隆抗體購自上海斯信生物科技有限公司提供，免疫組織化學試劑盒和二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，3-磷酸甘油醛脫氫(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)鼠單克隆抗體購自上海康成生物工程有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標本復制 成年雄、雌性小鼠合籠培育孕鼠。共9組，不同時間點各取10只。取胚齡(embryonic days,E)12 d胎鼠全胚；胚齡14 d至生后日齡(neonatal days,N)40 d小鼠腎臟，常規制備石蠟組織切片并提取蛋白。

1.2.2 免疫組織化學染色 切片脫蠟后，依次入100%乙醇2次，90%、80%和70%乙醇各1次，每次10 min，流水沖洗。配置枸櫞酸鈉修復液，加熱至沸騰，切片完全浸入修復液，高壓修復抗原2 min，室溫自然冷卻。取切片置于濕盒內，滴加3%過氧化氫反應10 min。滴加正常山羊血清封閉液反應1 h，輕輕甩去封閉液。滴加Slit2(1︰150)或Robo1(1︰150)4℃過夜。滴加聚合物輔助劑，37℃ 30 min。滴加辣根酶標記抗兔免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)聚合物，37℃ 30 min。滴加DAB顯色液，光學顯微鏡監測組織顯色情況。當鏡下可見明顯棕黃色時，切片放入蒸餾水以終止顯色。蘇木精復染細胞核。

1.2.3 蛋白印跡檢測 腎臟經超聲粉碎機粉碎，加適量裂解液裂解，低溫離心30 min，抽取上層液體，蛋白定量，分裝。安裝固定膠板，配膠，灌膠。蛋白樣品及內參經加熱變性后加樣。電泳分離(濃縮膠電壓90 V，分離膠電壓120 V)。轉膜(電壓50 V，室溫2 h)。5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗Slit2(1︰500)或Robo1(1︰500)4℃孵育過夜。Tween20-Tris緩沖鹽溶液(Tween20-Tris Buffered Saline,TTBS)洗膜30 min。二抗(1︰2 000)室溫孵育2 h，TTBS洗膜30 min。發光溶液A、B各15 ml避光混勻，加至膜上，凝膠電泳圖像分析儀拍照。以內參為標準，測定條帶光密度值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 16.0統計軟件，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色結果

Slit2在胚齡12 d小鼠腎臟的生腎區開始表達。其中，Slit2在小鼠輸尿管芽及其周圍的間充質聚集的部位陽性表達，其余部位無廣泛表達。在腎單位發育過程中，Slit2定位表達于逗號小體階段和S小體階段，且表達較強。在Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段及成熟腎小體階段有微弱的表達。Slit2在腎臟泌尿小管如近端小管、遠端小管及集合管發育過程中均有表達。見圖1～4。

圖1 Slit2在輸尿管芽和生后腎組織的表達(免疫組織化學染色×400)

圖2 Slit2在腎小體發育各階段的表達 (免疫組織化學染色×400)

圖3 Slit2在腎小管的表達(免疫組織化學染色×400)

圖4 Slit2在集合管的表達(免疫組織化學染色×400)

Robo1在胚齡12 d小鼠腎臟的生腎區開始表達。Robo1在小鼠生腎區廣泛表達，主要分布于生后腎組織和輸尿管芽上皮細胞基底面。在腎單位發育過程中，Robo1定位于逗號小體階段、S小體階段、Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段，且表達較強，在成熟腎小體階段表達微弱。Robo1在小鼠腎臟泌尿小管如近端小管、遠端小管及集合管發育過程中均有表達，主要分布于泌尿小管上皮細胞的基底面。見圖5～8。

圖5 Robo1在輸尿管芽和生后腎組織的表達(免疫組織化學染色×400)

圖6 Robo1在腎小體發育各階段的表達 (免疫組織化學染色×400)

2.2 蛋白印跡檢測結果

從小鼠胚齡14 d開始，Slit2蛋白表達隨著胚(日)齡的增加，先呈現遞增，胚齡16 d達峰值，隨后遞減。其中，Slit2蛋白表達在出生后1、7和40 d下調較為明顯(F=16.564，P=0.012)(見圖9)。Robo1蛋白表達隨著胚(日)齡的增加而遞減，在胚齡18 d、出生后1和14 d下調較為明顯；出生后一直維持低水平表達(F=13.483，P=0.016)。見圖10。

圖7 Robo1在腎小管內的表達 (免疫組織化學染色×400)

圖8 Robo1在集合管的表達 (免疫組織化學染色×400)

圖9 Slit2在小鼠腎臟發育各階段的表達

圖10 Robo1在小鼠腎臟發育各階段的表達

3 討論

本研究顯示，Slit2在胚齡12 d小鼠的輸尿管芽及輸尿管芽周圍的間充質聚集部位開始有陽性表達，其余部位未見表達。而Robo1在生腎區廣泛表達，主要分布于生后腎組織和輸尿管芽上皮細胞基底面。說明Slit2及其受體Robo1在小鼠腎臟早期發育即輸尿管芽的發生階段就開始發揮作用。且之前研究報道也稱Slit2基因敲除小鼠胚胎腎臟表現為多個輸尿管芽，從而產生多個腎臟，說明Slit2對于輸尿管芽的萌出起到關鍵的調控作用，其表達異常或基因缺失會影響輸尿管芽的正常發生過程[9-10]。在腎小體發育過程中，Slit2及其受體Robo1均有陽性表達。Slit2定位表達于逗號小體階段和S小體階段，且表達較強；在Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段及成熟腎小體階段有微弱的表達。Robo1定位表達于逗號小體階段、S小體階段、Ⅲ和Ⅳ期腎小體階段，且表達較強，在成熟腎小體階段有微弱的表達。兩者的表達部位一致，提示Slit2及其受體Robo1參與調控腎小體發生發育的全部過程。另有報道稱Robo受體家族中的Robo2表達于成熟腎小體的足細胞[11]。在糖尿病腎病患者腎小球中Robo2表達量下調，提示Robo2可能與腎臟腎小體足細胞功能的維持有關，參與調控足細胞的黏附力[12]。而本研究結果顯示Robo1未見在足細胞表達，表明其可能對足細胞的發育和功能作用不大。Slit2和Robo1在腎臟泌尿小管(近端、遠端小管及集合管)發育和成熟階段均明顯表達。可見，Slit2及其受體Robo1不僅參與腎小管和集合管的形態發生發育過程，對其功能維持也起到關鍵的調控作用。半定量分析結果表明，Slit2蛋白表達量隨著胚(日)齡的增加，先呈現遞增，胚齡16 d達峰值，隨后遞減。Robo1蛋白表達隨著小鼠胚(日)齡的增加而遞減，兩者略有差異，但生后兩者的變化趨勢基本一致。蛋白印跡檢測結果提示Slit2及其受體Robo1在生后表達較低，這可能與腎臟中腎小體的發育規律有關。對小鼠腎臟而言，腎小體的發育成熟主要集中在胚齡14 d到生后7 d。在生后7 d，隨著生腎區的消失，腎小體發育成熟，數目不再增加[13]。而本研究結果提示，Slit2和Robo1主要在發育過程中的腎小體表達明顯，而在成熟腎小體微弱表達。可見，Slit2和Robo1的蛋白表達變化規律與腎小體的發育規律是一致的。前期試驗證實，膠質細胞系源性神經營養因子(glial cell linederived neurotrophic factor,GDNF)/GDNF家族受體α1(GDNF family receptor α1,GFRα1)/受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RET)信號通路參與調控小鼠腎臟發育[14]。根據文獻報道，GDNF調控輸尿管芽發生、發育。而在Robo2小鼠體內后腎間充質出現GDNF表達區域擴大，多個輸尿管芽發生的現象[15]。提示這2個信號系統可能存在關聯，Slit/Robo信號通路是否通過調控GDNF的表達來影響腎臟的早期發育，這些都需要進一步的實驗進行驗證。

綜上所述，Slit2及其受體Robo1在腎臟發生和發育過程中有廣泛表達，如后腎發生階段出現的輸尿管芽、生后腎組織、各期腎小體、發育及成熟階段的泌尿小管(近端小管、遠端小管及集合管)。可見，Slit2及其受體Robo1對于腎臟的發生階段、中后期的分化階段及成熟后的功能維持階段均可發揮一定的作用。結合相關文獻報道，有理由推測Slit2及其受體Robo1是腎臟發生、發育的必備調控因素，其表達異常會導致腎發育畸形及功能異常，從而引發相關臨床癥狀。本研究不僅為闡明腎發育畸形的可能機制提供理論依據，同時也為腎發育畸形的臨床診斷、治療和預防提供思路。另外，本研究結果對Slit2及其受體Robo1在腎臟的表達進行系統觀察和定位，也為后續的深入探究Slit2及其受體Robo1的功能提供了形態學依據。相信隨著研究的不斷推進，對腎發育畸形的發病機制將有更全面的認識和了解。