間歇性低壓低氧對大鼠肺動脈高壓的預防作用及血管保護機制

(河北醫科大學第一醫院 心內科，河北 石家莊 050031)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension,PAH)是以肺動脈壓力升高以及血管痙攣、內膜增生和重構為主要特征的一種病理狀態，目前對PAH的發病機制尚未闡明，但已明確內皮功能失調是PAH發生及發展的重要病理生理基礎，因此恢復受損的血管內皮功能是治療PAH的重要策略。間歇性低壓低氧(intermittent hypobaric hypoxia,IHH)是指實驗動物間斷暴露于低壓低氧環境，而其余時間處于常壓常氧環境中。已有研究表明，IHH對機體有很多益處，但國內外尚未見對PAH大鼠具有預防及保護作用的研究報道。

本實驗采用野百合堿(Monocrotaline,MCT)誘導雄性SD大鼠PAH模型，觀察IHH對PAH大鼠模型的肺組織及肺血管功能學、形態學的作用，并初步探討其對肺血管的保護機制，為臨床治療PAH提供新的實驗及理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康雄性SD大鼠40只購于河北醫科大學實驗動物中心，體重150～200 g。大鼠隨機分為正常對照組8只(CON組)、肺動脈高壓組12只(PAH組)、間歇性低壓低氧組8只(IHH組)和IHH+MCT組12只。

1.2 實驗藥品及實驗溶液的配置

1.2.1 實驗藥品 MCT、苯腎上腺素(Phenylephrine,PHE)、乙酰膽堿(Acetylcholine,ACH)、4%水合氯醛溶液。

1.2.2 Krebs-Henseleit(KH)溶液的配制 氯化鈉NaCl 3.45 g，氯化鉀KCl 0.175 g，氯化鈣CaCl20.1 g，磷酸二氫鉀KH2PO40.0815 g，硫酸鎂MgSO40.148 g，碳酸氫鈉NaHCO31.05 g，葡萄糖1.1 g(pH 7.35～7.45)，配置成500 ml溶液。

1.3 實驗分組及干預

1.3.1 CON組 大鼠飼養28 d后直接用PE-50管檢測右心室收縮壓(right heart systolic pressure,RVSP)及肺動脈平均壓(mean pulmonary artery pressure,mPAP)，計算右心室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index,RVHI)，并用血管環灌流實驗觀察血管反應性的改變。本組實驗持續28 d。

1.3.2 PAH組 大鼠先正常飼養14 d，后以60 mg/kg的劑量一次性腹腔注射MCT，以誘導大鼠慢性PAH模型，在注射14 d后測量PAP，如果＞25 mmHg則入組。本組實驗持續28 d。

1.3.3 IHH組 大鼠置于模擬5 km海拔高度(氧濃度11.1%，大氣壓400 mmHg)的低壓低氧艙，6 h/d，其余時間仍處在正常氧氣及氣壓條件下，連續經受28 d的IHH后進行實驗。本組實驗持續28 d。

1.3.4 IHH+MCT組 大鼠先接受上述的低壓低氧處理28 d后，用MCT以60 mg/kg劑量一次性腹腔注射，14 d后進行實驗。本組實驗持續42 d。

1.4 實驗方法和步驟

1.4.1 復制PAH模型 PAH組實驗大鼠一次性腹腔注射MCT溶液(60 mg/kg)，有研究表明，在注射14 d即可形成理想的大鼠PAH模型[1-3]。該研究在注射MCT后14 d應用Powerlab生物信息采集與處理系統中的肺動脈壓力測定模板測量肺動脈壓(PAP)，如果PAP＞25 mmHg時，則認為復制模型成功。本實驗中大鼠經測量均復制成功。

1.4.2 血流動力學測定 大鼠稱重后用水合氯醛行腹腔注射麻醉。啟動Powerlab生物信息采集與處理系統，接通三通管后與換能器和監護儀相連，并將壓力校零備用。將麻醉后的大鼠暴露右側頸總靜脈后用PE-50管緩緩插入，PE-50管的另一端與壓力換能器相連，緩慢操縱導管，根據屏上所顯示的壓力值與壓力曲線的變化來判斷導管的位置，當出現典型的右心室壓力波形及肺動脈壓力波形后，固定導管位置，記錄Powerlab生物信息采集處理系統中的RVSP及PAP值，通過數據分析得出mPAP壓力值。

1.4.3 RVHI的計算 血流動力學檢測結束后迅速開胸，將心臟取出并用K-H液沖洗干凈。剪下心臟后沿著房室間溝剪去心房及周圍血管組織，之后經肺動脈出口沿肺動脈圓錐、室間隔將右心室游離壁分離，余下的即為左心室及室間隔組織(Left ventricle and septum，LV+S)，用濾紙吸干組織上的水分后秤量RV游離壁以及LV+S的重量，計算RV/(LV+S)%比值即為RVHI，反映肺動脈高壓的程度。

1.4.4 大鼠離體肺動脈環的復制 將上述開胸后的大鼠剪取左肺葉置于K-H液硅膠培養皿中并固定，在顯微鏡下暴露肺葉內的肺動脈及其分支，剝離兩側結締組織，游離出肺動脈，選取直徑介于300～500 μm的肺中動脈剪成長約為2 mm的離體肺動脈環。

1.4.5 肺動脈環體外灌流實驗的操作步驟 打開DMT Myograph Systems，將肺血管環懸掛于預置5 ml K-H液的浴槽內，并進行血管的標準化來算出血管的初始張力，基線穩定后用PHE(10-5mol/L)收縮血管環達張力峰值，加入ACH(10-5mol/L)檢驗血管內皮完整性。反復沖洗，待血管環重新穩定后，加入累積濃度的PHE(10-8～10-5mol/L)，即加入1個濃度的PHE，待反應穩定之后再加入另一濃度，獲取濃度-效應曲線反映血管內皮依賴性收縮功能；反復沖洗待血管環張力重新平衡后，用PHE(10-5mol/L)預收縮血管環引起最大收縮反應后，逐漸加入系列濃度梯度(10-8～10-5mol/L)的ACH，從而獲得ACH的累積濃度-效應曲線反映內皮依賴性血管舒張功能。

1.5 統計學方法

肺動脈環體外灌流實驗的每組數據先分別計算不同濃度梯度下藥物對離體肺動脈血管環的收縮或舒張的張力值，然后用血管環的收縮或舒張張力值占PHE(10-5mol/L)的最大收縮百分比表示，并繪出累積濃度-效應曲線。數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，實驗結果均為服從正態分布的計量資料，計量資料以均數±標準差(±s)表示，4組數據比較運用單因素方差分析，當多組間比較有統計學意義時，兩兩比較應用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物的一般生長狀況與死亡情況

PAH組大鼠從腹腔注射MCT后1周開始體重較對照組減輕，倦臥，喘促，活動量、進食量減少。處死后開胸，可見肺表面光滑，呈灰白色，彈性差，多處局灶性瘀血，右心室明顯增厚。IHH組大鼠的活動度、進食狀況及重量均較PAH組有所改善，但較CON組差，處死后見肺表面光滑，呈粉色，但彈性差。CON組大鼠處死后可見肺表面光滑，呈粉紅色，富有彈性。PAH組死亡2只大鼠，其余各組大鼠均全部存活。死亡大鼠行解剖實驗，肉眼可見有胸腹腔積液，摘取心、肺組織后，可見肺組織瘀點、瘀斑，短軸橫切心臟，可看到右室游離壁肥大。

2.2 各組大鼠RVSP和mPAP比較

4組大鼠RVSP和mPAP比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義(P＜0.05)。PAH組的RVSP和mPAP與其他3組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，PAH組高于其他3組；IHH+MCT組大鼠的RVSP和mPAP與PAH組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，IHH+MCT組低；IHH+MCT組、IHH組的RVSP和mPAP與CON組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，IHH+MCT組和IHH組偏高。見表1和圖1。

表1 各組大鼠RVSP、mPAP、RV、LV+S及RVHI比較 (±s)

表1 各組大鼠RVSP、mPAP、RV、LV+S及RVHI比較 (±s)

注:1)與CON組比較，P ＜0.05；2)與CON組比較，P ＞0.05；3)與PAH組比較，P ＜0.05

組別RVSP/mmHgmPAP/mmHgRV/mgLV+S/mgRVHI/%CON組(n =8)24.464±1.21416.423±0.4660.103±0.0360.420±0.0280.244±0.038 PAH組(n =10)45.145±0.6231)35.282±0.9461)0.246±0.0631)0.582±0.0321)0.488±0.0281)IHH組(n =8)25.743±1.1632)17.863±0.4282)0.161±0.0272)0.504±0.0322)0.277±0.0422)IHH+MCT組(n =12)27.585±0.9872)3)19.456±1.0352)3)0.125±0.0242)3)0.488±0.0452)3)0.256±0.0412)3)F值11.24710.14319.54825.17924.434 P值0.0000.0000.0000.0000.000

圖1 各組大鼠RVSP、mPAP比較

2.3 各組大鼠RV、LV+S和RVHI比較

4組大鼠RV、LV+S、RVHI比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義(P＜0.05)。PAH組的RV、LV+S、RVHI與其他3組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，PAH組高于其他3組，IHH+MCT組的上述指標較PAH組顯著降低；IHH+MCT組、IHH組的指標與CON組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，但IHH+MCT組和IHH組偏高。見表1和圖2。

圖2 各組大鼠RV、LV+S和RVHI比較 (±s)

2.4 各組大鼠離體肺動脈的血管功能

在4組中，PHE從10-8mol/L到10-5mol/L均可引起血管內皮依賴性收縮反應，ACH從10-8mol/L到10-5mol/L都可引起血管的內皮依賴性舒張反應，且以上實驗藥物對血管的收縮及舒張作用都具有濃度依賴性。

2.4.1 離體肺動脈環對PHE的血管內皮依賴性收縮反應 由PHE誘導的肺動脈環的血管內皮依賴性收縮功能PAH組大鼠與CON組大鼠比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，PAH組減弱(見表2)，這種效應在PHE的量效關系曲線上表現為曲線的右移(見圖3)。但是，IHH+MCT組的內皮依賴性的收縮功能較PAH組增強，即IHH預處理28 d可改善PAH組大鼠受損的肺動脈內皮依賴性收縮功能。

2.4.2 離體肺動脈環對ACH的血管內皮依賴性舒張反應 ACH誘導的肺動脈環的血管內皮依賴性舒張功能PAH組大鼠與CON組大鼠比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，PAH組減弱(見表2)，這種效應在ACH的量效關系曲線上表現為曲線的右移(見圖4)。但是，IHH+MCT組的內皮依賴性舒張功能較PAH組增強，即IHH預處理28 d后可改善PAH組大鼠受損的肺動脈內皮依賴性舒張功能。

圖3 各組由PHE誘導的離體肺動脈環的血管內皮依賴性收縮功能比較

表2 各組大鼠累積濃度的收縮及舒張效應 %

圖4 各組由ACH誘導的離體肺動脈環的血管內皮依賴性舒張功能比較

3 討論

已有研究表明，IHH對機體多種組織、器官均有益處[4-6]，例如可保護神經及肝臟等器官組織[7]；可對抗代謝綜合征大鼠的血壓升高和胰島素抵抗[8]；也有文獻報道IHH可對抗缺血/再灌注所致心功能損傷及心律失常[9]，增強機體對缺血、缺氧的耐受性；SANCHIS-GOMAR[10]等的研究證明IHH對心肌梗死的預防和恢復均有保護作用；FARIAS[11]等的研究也證明IHH對運動員在常氧運動時紅細胞的生成、最大攝氧量和能量消耗具有保護作用。有關IHH對機體的有益作用日益受到關注，但其對PAH的預防作用目前國內外報道均少見。

目前關于PAH的發病機制尚未完全闡明，但已明確內皮功能失調是PAH發生及發展的重要病理生理基礎[12]。正常情況下血管內皮細胞可分泌內皮依賴性舒張因子(endothelium-derived relaxing factor,EDRF)及內皮依賴性收縮因子(endothelium-dependent contraction factor,EDCF)作用于平滑肌細胞而發揮血管活性作用。如果發生內皮功能障礙，則NO等EDRF減少或活性降低，而O2等EDCF釋放增加，使肺血管收縮及重構，最終導致PAH，因此恢復受損的血管內皮功能是治療PAH的重要策略。

本研究發現，未經過IHH預處理的實驗組大鼠MCT腹腔注射后2周，其肺動脈壓力升高，右心室肥厚，而這種效應能夠被IHH預防治療所消減。因此得出這樣的結論:IHH干預后可降低MCT所誘導的升高的大鼠肺動脈壓及右心室肥厚。

LIN等[13]的研究表明MCT誘導的PAH大鼠離體肺動脈由ACH介導的內皮依賴性舒張反應減弱，其潛在的機制可能是血管平滑肌細胞對EDCF的敏感性增高以及對內皮源性的NO的反應性降低[14]。ELIF等[15]將MCT誘導的PAH大鼠于21d后處死，游離出肺動脈主干做離體肺動脈環實驗，并使用去甲腎上腺素預收縮肺動脈干后觀察其由電場刺激介導的舒張反應，結果顯示與正常對照組相比，PAH組電場刺激介導的舒張功能消失，這表明MCT誘導的PAH大鼠電場刺激介導的舒張功能減弱是由于內皮NO的產生受抑制而引發。

本研究在血管環灌流實驗中發現，在MCT誘導的PAH組中，由ACH誘導的內皮依賴性血管舒張反應較正常對照組大鼠降低，這與MAM等[16]的研究結果相同。但是，IHH+MCT組的內皮依賴性舒張功能較PAH組增強，即IHH預處理28 d后可改善PAH組大鼠受損的肺動脈內皮依賴性舒張功能。因此，通過上述結果筆者推斷早期運用IHH對MCT誘導的PAH大鼠肺動脈的舒張功能具有保護作用，其作用機制可能是由于肺血管結構的改變降低了其對血管收縮物質的反應性，這與WITTMER等[17]的研究相同。也有學者研究證實IHH能夠通過開放動脈血管KATP通道和增加NO濃度減緩MCT誘導的PAH的進展，改善內皮依賴性的血管舒張功能[18-19]。

本研究應用先進的DMT Myograph Systems，為臨床治療PAH提供一種預處理的非藥物性措施及新的思路，同時也有助于更加深入地理解PAH的病理進展。