共表達分子伴侶PDI和Ero1對葡萄糖氧化酶在畢赤酵母中表達的影響

高慶華 董聰 王玥 胡美榮 王慶慶 王云鵬 羅同陽 劉蕾

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國科學院微生物研究所，北京 100101）

葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，GOD）的系統命名為β-D-葡萄糖氧化還原酶（EC1.1.3.4），是一種需氧脫氫酶，專一催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氫。GOD的催化特性使其具有去葡萄糖、脫氧、殺菌等功能，且安全無毒無副作用，是國家允許使用的酶制劑之一，在食品的加工保鮮、醫學檢測等方面都有廣泛應用［1］。

GOD在自然界廣泛分布，來源包括昆蟲、紅藻類、巧橘類水果、細菌和真菌等動植物、微生物體。目前用于生產的工業化菌種主要有黑曲霉和點青霉；但是對于工業化大規模生產來說，一個高效且經濟的生產系統是迫切需要的［2］。畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統已經發展成為一個成熟的外源蛋白表達系統，已有上千種蛋白在畢赤酵母系統中得到成功表達。近些年，畢赤酵母被美國FDA認定為GRAS（Generally recognized as safe），為其在食品及醫藥上應用鋪平了道路［3］。Crognale等［4］選擇了甲醇營養型畢赤酵母作為宿主，將 GOD 基因整合入P. pastoris X33異源表達，通過3 L發酵罐培養發酵，GOD 活性到了 50 U/mL，相比野生型菌株產量提高了近 4倍。Guo等［5］將GOD基因整合到畢赤酵母中，搖瓶水平發酵酶活達到40 U/mL，是出發菌株A.niger Z-25的20倍。

隨著畢赤酵母表達系統的廣泛化應用，該系統的一些自身的缺陷也逐漸暴露出來。某些外源蛋白的表達水平過高，超過了宿主細胞翻譯后處理加工能力所能承擔的最大負荷，引起蛋白的錯誤折疊、不加工或錯誤定位，進而導致目的蛋白在內質網腔中形成多聚體，并阻滯在內質網妨礙其功能，或者分泌到胞外的蛋白質無活性。這些問題越來越成為阻礙畢赤酵母表達系統應用于高水平表達的瓶頸問題［2］。

研究表明，分子伴侶的大量表達可以促進蛋白折疊。內質網氧化還原酶（Endoplasmic reticulum oxidation 1，Ero1）和二硫鍵異構酶（Protein disulfide isomerase，PDI）均為內質網腔中的信號肽，其中PDI 的氧化活性幫助蛋白形成正確的折疊結構而分泌到胞外，對內質網腔內蛋白質二硫鍵的形成具有促進作用，幫助蛋白質分泌［6］；Ero1在內質網中氧化還原態的PDI 成氧化態，間接幫助蛋白分泌［7］。陳飛等研究發現單獨整合 PDI 及同時整合 Ero1、PDI 畢赤酵母菌株的 CiP酶活分別提高了 2.43 和2.62倍［8］；陳鳳祥等［9］在畢赤酵母中共表達Ero1和PDI分別使IFNβ-HSA 的表達量提高了80%和90%。

本研究中，在前期研究中我們已經克隆了一株來源于高產葡萄糖氧化酶點青霉的GOD基因，并篩選獲得了畢赤酵母基因工程菌株X33-pMD-GOD［10］，在此基礎上，研究進一步通過共表達分子伴侶PDI基因及同時共表達分子伴侶Ero1-PDI基因對菌株的生長和分泌外源蛋白質GOD的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒 大腸克隆菌株DH5α購自天根生化科技有限公司；酵母表達菌株X33-pMD-AOXGOD由作者實驗室構建并保藏；分子伴侶表達載體pPICZ A由中科院微生物研究所提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內切酶BstB I、Not I、BamH I、Sfo I購自NEB公司；核酸 Marker購自上海生工；蛋白 Marker購自Thermo公司；G418和Zeocin購自Invitorgen 公司；其他試劑均為國產分析純；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自天根生化科技有限公司；PCR 儀購自東勝創新生物科技有限公司和Power B電泳儀和MINI P-4電泳系統購自凱元信瑞儀器有限公司公司；全自動凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司；引物和DNA 測序由上海生工完成。

1.1.3 培養基 （1）畢赤酵母培養基：YPD和BMGY 參照文獻配制。（2）分批發酵BSM培養基：參照文獻配制。（3）補料培養基：含12 mL/L PTM1的50%甘油。（4）誘導培養基：含12 mL/L PTM1的100%甲醇，同時補加50%山梨醇。

1.2 方法

1.2.1 分子伴侶基因 PCR擴增 分子伴侶蛋白Ero1 和PDI 基因序列分別以GenBank公布的登錄號XM_002489600.1和EU805807.1設計合成引物，引物兩端均分別含有BstB I和Not I酶切位點（表1），以畢赤酵母的基因組為模板擴增出 Ero1和 PDI基因序列。PCR擴增條件：98℃ 5 min；98℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 60 s，共 30 個循環 ；72℃ 10 min。

1.2.2 分子伴侶重組質粒構建 將PCR產物純化后連接pGM-T克隆載體上，轉化E.coli DH5α，提質粒進行測序鑒定。將得到的陽性克隆質粒采用BstB I和Not I雙酶切，純化后與同樣雙酶切載體pPICZ相連接，篩選陽性克隆驗證，獲得重組質粒pPICZ/Ero1和pPICZ/PDI。將基因測序正確的重組質粒pPICZ/PDI利用引物EP-F和EP-R擴增出含有AOX啟動子、PDI基因以及終止子區域的目的片段，與測序正確且BamHI線性化的重組質粒pPICZ/Ero1進行同源重組，采用NOVO protein同源重組方法，構建克隆載體pPICZ/Ero1-PDI。轉化E. coli DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行PCR鑒定、測序，獲得構建成功的重組質粒pPICZ/Ero1-PDI。

表1 分子伴侶基因PCR擴增引物列表

1.2.3 陽性轉化子的獲得 將測序正確的重組質粒pPICZ/PDI和pPICZ/Ero1-PDI分別用SfoI限制內切酶進行線性化后，分別電擊轉化同一株X33-pMDAOX-GOD感受態細胞，電轉條件一樣（1.5Kv、5 ms）。然后加入預冷的YPDS 30℃靜置培養2-6 h后，涂布在終濃度 250 μg/mL G418和50 μg/mL Zeocin的YPD雙抗平板上，置于30℃培養3 d后獲得轉化子。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達 將重組菌株X33/pMDGOD和分別整合分子伴侶PDI，Ero1-PDI的X33/pMD-GOD菌株進行YPD平板劃線培養，挑取單菌落接種于5 mL YPCS試管種子培養基中，20-24 h后加 1%（V/V）甲醇誘導，之后培養到48 h和 72 h各加1%（V/V）甲醇誘導，96 h收菌，8000 r/min離心 5 min收集上清，上清進行酶活檢測。

1.2.5 畢赤酵母胞內蛋白的提取 收集酵母細胞（約1010個細胞酵母），以PBS緩沖液清洗兩遍后，重懸于 450 μL畢赤酵母總蛋白提取緩沖液，加入等體積的酸處理過的玻璃珠，渦旋震蕩 1 min，置于冰上 30 s，重復 10 次。4℃，16000×g，離心20 min，所得上清即為酵母胞內總蛋白提取液。采用BCA法定量蛋白上樣量。

1.2.6 GOD的酶活測定 GOD 活性測定方法參照文獻，采用鄰一聯（二）茴香胺分光光度法。1個酶活力單位是指在37℃、pH5.0條件下，在1 min內轉化 1 μmol葡萄糖生成 1 μmol葡萄糖酸和 H2O2所需的酶量。

1.2.710 L發酵罐放大表達GOD 選取試管水平上葡萄糖氧化酶活性最高的轉化子，在10 L發酵罐條件下進行GOD的表達。挑單克隆接種于 YPD培養基培養 10 h，按 3%接種量轉接于 100 mL BMGY 培養基至OD600≈6接種于10 L發酵罐，初期裝液量為 5.6 L BSM培養基，高壓滅菌20 min后，以 10%發酵體積接種。期間每隔24 h 加維生素C 水溶液（終濃度80 μg/L），30℃培養，每12 h取樣測定發酵液酶活；上清液進行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察GOD 蛋白質的表達。具體方法參照文獻［10］。

2 結果

2.1 共表達PDI、Ero1-PDI酵母菌株的構建

以P. pastoris X33基因組為模板，PCR擴增獲得pdi和ero1基因，PCR產物經1%核酸電泳驗證如圖1-A，在1500 bp左右可見明顯的特異性條帶，其大小與目標序列預期相符。將純化后的基因與克隆載體pMD 18-T連接后測序，測序結果與GenBank中收錄的序列一致（GenBank編號：AJ302014和8197528）。

將測序正確的pMD 18-T-pdi、pMD 18-T-ero1和表達載體pICZ A同時進行BstB I和Not I雙酶切，膠回收純化后用T4連接酶16℃連接過夜，T1擴增，提取質粒后雙酶切，酶切結果經1%核酸電泳分析，如圖1-B所示，在2900 bp和1500 bp左右有特異性DNA條帶，表明重組質粒構建正確，獲得了克隆載體pMD-ERO1和pMD-PDI。

將基因測序正確的重組質粒pMD-PDI利用引物EP-F和EP-R擴增出含有AOX啟動子、PDI基因以及終止子區域的目的片段，與測序正確且BamH I線性化的重組質粒pMD-ERO1進行同源重組，采用NOVO protein同源重組方法，構建克隆載體pMDERO1-PDI。

2.2 陽性轉化子的篩選-試管水平檢測分子伴侶對GOD表達的影響

圖1 PCR擴增產物和重組質粒的鑒定

將X33/pMD-AOX-GOD菌株作為空白菌株，與分別整合分子伴侶PDI和Ero1-PDI的X33/pMDAOX-GOD菌株按照上述條件進行搖瓶發酵。空白菌株酶活14.376 U/mL，其中整合PDI的GOD菌株P-6和P-7酶活分別為22.539 U/mL和22.204 U/mL，酶活分別提高了56.8%和54.5%；同時整合Erol，PDI的GOD菌株EP-1、EP-8和EP-15酶活分別為達到21.001 U/mL、24.635 U/mL 和 25.321 U/mL（ 圖 2），酶活分別提高了46.0%、71.4%和76.1%。

由圖2可知，整合PDI菌株少部分菌株的酶活還有降低的現象；整合Erol-PDI菌株蛋白表達均較對照有較大的提高。

圖2 共表達分子伴侶對GOD酶活的影響

進一步驗證分子伴侶的表達量的多少是否與GOD的表達相關，研究了P-1、P-7、EP-8和EP-15共表達的分子伴侶的胞內表達和GOD表達的關系。從圖3-A和圖3-B中可以看出整合分子伴侶PDI和Ero1-PDI的X33/pMD-AOX-GOD菌株的PDI表達量明顯高于對照菌株，菌株EP-15的PDI表達量最高，其目的蛋白GOD的表達量也最高，酶活也最高。

圖3 葡萄糖氧化酶胞外表達（A）和分子伴侶胞內表達（B）檢測

2.310 L發酵罐表達GOD

將對照菌株X33 /pMD-GOD和整合伴侶蛋白PDI及PDI/ERO1的菌株P-7和EP-15采用甲醇/山梨醇混合碳源流加方式進行10 L發酵罐放大培養。誘導表達144 h后下罐，發酵液上清進行SDS-PAGE分析（圖4）；對照菌株誘導156 h下罐時酶活為367 U/mL（圖5-A），整合了分子伴侶的菌株蛋白表達量明顯高于對照菌株（圖5-B和C），同時整合伴侶蛋白Erol-PDI的EP-15菌株下罐酶活最高，誘導132 h 時酶活還未達到峰值，在156 h時達到了736 U/mL（圖5-C），比對照菌株下罐時酶活提高了1倍。

3 討論

畢赤酵母表達系統已經是一種成熟的外源蛋白表達系統，提高酵母表達外源蛋白水平的工藝方法研究一直備受關注［11-12］。通過在畢赤酵母X33 中分別單獨表達分子伴侶PDI及同時共表達分子伴侶Ero1-PDI，探索了過量表達內質網中這兩種蛋白質折疊輔助因子對外源蛋白質GOD分泌表達的影響。GOD由兩個相同編碼序列編碼的同型二聚體分子構成，通過二硫鍵結合，二級結構中主要是β折疊［13］。已有研究表明，酵母細胞表達外源蛋白分泌產率與PDI 及二硫鍵形成有很大的相關性。酵母中 PDI 的過量表達能大幅度的提高外源蛋白的表達水平，尤其是含較多二硫鍵的蛋白［8，14］。另外，在畢赤酵母中表達Ero1使目的蛋白的表達量提高［9］。

圖4 SDS-PAGE分析10 L發酵罐對照菌株（CK）和添加分子伴侶菌株GOD表達情況（P-7、EP-8及EP-15）

圖5 GOD空白對照菌株（（A）、添加分子伴侶菌株PDI及同時整合PDI-ERO1菌株（B）在10 L發酵罐中誘導生長和酶活分析

我們通過Ero1、PDI成功地在胞內過量表達，發現其首先并不影響宿主細胞的正常生長；其次在10 L 發酵罐放大實驗研究發現單獨整合PDI和同時整合Ero1-PDI 菌株酶活與表達量均有明顯提高，其中整合Ero1-PDI 菌株的發酵酶活為736 U/mL 比對照菌株的發酵酶活367 U/mL整整提高了1倍。這說明當Ero1、PDI 以及GOD 共表達時，PDI 在幫助GOD形成二硫鍵時，本身被還原，Ero1 可以將PDI氧化，使其重新恢復功能，從而促進GOD 的表達。而且，分子伴侶的表達越多對其目的蛋白的表達越有利，這或與分子伴侶的表達也受甲醇誘導有關。但是，不是所有酶的表達，都與PDI的表達成正比［15］。

本研究通過整合分子伴侶促進蛋白正確折疊從而提高蛋白表達為以后在畢赤酵母細胞中的表達外源基因提供了新的思路和借鑒。分子伴侶是一個相互影響、相互作用的有機整體，如Ero1與PDI之間存在的相互作用，應該根據目的蛋白的結構特征，選擇合適的分子伴侶優化表達組合。除此之外，還應該考慮分子伴侶與啟動子、信號肽的組合及發酵工藝條件等，進行條件優化設計研究。

4 結論

本研究在工程菌X33/pMD-GOD中共表達分子伴侶PDI-Ero1 得到菌株X33/pMD-GOD/pPICZ-PDIEro1。在10 L 發酵罐放大實驗過程中，采用甲醇/山梨醇混合碳源誘導的策略，GOD 最終酶活為736 U/mL，比對照菌株提高了1倍。