登革熱診斷

中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會

本標(biāo)準(zhǔn)第5章為強(qiáng)制性條款，其余為推薦性條款。

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)代替WS 216—2008《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》。

本標(biāo)準(zhǔn)與WS 216—2008相比，主要技術(shù)變化如下：

——修改了適用范圍(見第1章，2008年版的第1章)；

——術(shù)語和定義刪除了束臂試驗，增加了重癥登革熱和NS1抗原(見第2章，2008年版的第2章)；

——修改了臨床表現(xiàn)(見第3章，2008年版的3.2)；

——修改了實驗室檢查(見第3章，2008年版的3.3)；

——刪除了“血液濃縮；低白蛋白血癥”指標(biāo)(見2008年版的3.3.3)；

——增加了“發(fā)病5 d內(nèi)的登革病毒NS1抗原檢測陽性”指標(biāo)(見第3章，2008年版的3.3)；

——修改了疑似病例(見第5章，2008年版的5.1)；

——修改了臨床診斷病例(見第5章，2008年版的5.2)；

——修改了確診病例(見第5章，2008年版的5.3)；

——增加了重癥病例(見第5章，2008年版的5.4)；

——調(diào)整了附錄A和附錄B的順序；

——附錄A中增加了“酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒NS1抗原”方法，刪除了原有的“血凝抑制(HI)試驗檢測登革病毒血凝抑制抗體”方法(見附錄A和附錄B，2008年版的附錄A和附錄B)；

——修改了附錄D中內(nèi)容，將原有的“登革出血熱”和“登革休克綜合征”改為“重癥登革熱”，將重癥登革熱的高危人群和早期識別重癥病例的預(yù)警指征納入(見附錄D，第5章，2008年版的附錄D)。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：廣東省疾病預(yù)防控制中心、廣州市第八人民醫(yī)院、中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所、中國疾病預(yù)防控制中心、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院、中國軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：何劍峰、張復(fù)春、王世文、殷文武、李建東、李興旺、秦成峰、王建、吳德、鄧愛萍。

本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為：

——WS 216—2001；

——WS 216—2008。

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了登革熱的診斷依據(jù)、診斷原則、診斷和鑒別診斷。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于各級各類醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)及其醫(yī)務(wù)人員對于登革熱病例的診斷。

2 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

2.1 重癥登革熱(severe dengue) 登革熱的一種嚴(yán)重類型，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重出血、休克、嚴(yán)重臟器損傷等。

2.2 NS1抗原(NS1 antigen) 登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中的一種糖蛋白，其大量存在于感染細(xì)胞的表面，可作為早期診斷的特異性指標(biāo)。

3 診斷依據(jù)

3.1 流行病學(xué)史 發(fā)病前14 d內(nèi)，曾經(jīng)到過登革熱流行區(qū)，或居住場所或工作場所周圍1個月內(nèi)曾出現(xiàn)過登革熱病例。

3.2 臨床表現(xiàn)

3.2.1 一般表現(xiàn) 急性起病，突發(fā)高熱，明顯疲乏、厭食、惡心等，常伴有較劇烈的頭痛、眼眶痛、全身肌肉痛、骨關(guān)節(jié)痛等癥狀，可伴面部、頸部、胸部潮紅，結(jié)膜充血等。

3.2.2 皮疹 于病程第3天～第6天在顏面四肢出現(xiàn)充血性皮疹或點狀出血疹。典型皮疹為見于四肢的針尖樣出血點及“皮島”樣表現(xiàn)等。皮疹分布于四肢軀干或頭面部，多有癢感，不脫屑。持續(xù)3～5 d。

3.2.3 出血傾向 部分患者可出現(xiàn)不同程度的出血表現(xiàn)，如皮下出血、注射部位瘀點、牙齦出血、鼻衄及束臂試驗陽性等。

3.2.4 嚴(yán)重出血 皮下血腫，肉眼血尿，消化道、胸腹腔、陰道、顱內(nèi)等部位出血。

3.2.5 嚴(yán)重臟器損傷 急性心肌炎、急性呼吸窘迫綜合征、急性肝損傷、急性腎功能不全、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等表現(xiàn)。

3.2.6 休克 心動過速、肢端濕冷、毛細(xì)血管充盈時間延長＞3 s、脈搏細(xì)弱或測不到、脈壓差減小或血壓測不到等。

3.3 實驗室檢查 ①白細(xì)胞計數(shù)減少和(或)血小板減少。②登革病毒IgM抗體陽性(見附錄A中A.1、A.2)。③發(fā)病5 d內(nèi)的登革病毒NS1抗原檢測陽性(見附錄A.3)。④登革病毒恢復(fù)期血清特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍及以上增長或陽轉(zhuǎn)(見附錄A.4、A.5)。⑤從急性期患者血液、腦脊液或組織等中分離到登革病毒(見附錄B中B.1、B.2)。⑥應(yīng)用RT-PCR或?qū)崟r熒光定量RT-PCR檢出登革病毒核酸(見附錄B.3、B.4)。

4 診斷原則

依據(jù)患者的流行病學(xué)證據(jù)、臨床表現(xiàn)及實驗室檢查結(jié)果進(jìn)行綜合判斷。

5 診斷

5.1 疑似病例 符合下列一項可診斷為疑似病例：a)符合3.1，并同時符合3.2.1；b)同時符合3.2.1和3.3中的①。

5.2 臨床診斷病例 符合下列一項可診斷為臨床診斷病例：a)符合5.1a)；并同時符合3.2.2、3.2.3中任一項和3.3中的①；b)符合5.1，并同時符合3.3中的②③任一項。

5.3 確診病例 符合5.1或5.2，并同時符合3.3中的④⑤⑥任一項可診斷為確診病例。

5.4 重癥登革熱 符合5.2或5.3，并同時符合3.2.4、3.2.5、3.2.6中任一項可診斷重癥登革熱。

6 鑒別診斷

登革熱應(yīng)與麻疹、風(fēng)疹、猩紅熱、流行性感冒、基孔肯雅熱、寨卡病毒病相鑒別；重癥登革熱應(yīng)與鉤端螺旋體病、腎綜合征出血熱、恙蟲病等相鑒別。參見附錄C與附錄D。

附錄A

（規(guī)范性附錄）

登革熱血清學(xué)檢測方法

A.1 應(yīng)用IgM捕捉酶聯(lián)免疫吸附試驗(Mac-ELISA)檢測登革病毒IgM抗體

A.1.1 原理 根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，利用抗人μ鏈單克隆抗體捕獲待檢測血清中的IgM，再加入特異性抗原和相應(yīng)酶標(biāo)單克隆抗體，加底物顯色。顯色程度與特異性IgM抗體含量呈正相關(guān)。

A.1.2 材料和試劑 所需材料和試劑如下：a)洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫溫箱或水浴箱(37 ℃±2 ℃)；b)10～100 μL可調(diào)移液器、10 mL吸管；c)稀釋血清用的試管、吸水紙；d)蒸餾水或去離子水；e)登革病毒IgM抗體捕捉ELISA診斷試劑盒。

A.1.3 檢測方法 具體步驟如下：a)在一系列試管中，將陰、陽性對照血清，臨界值較準(zhǔn)血清和待檢血清稀釋成1∶100；b)吸取所需量的純化登革病毒抗原和等體積辣根過氧化物酶標(biāo)記單克隆抗體至另一干凈的玻璃瓶或試管中，混勻后置室溫作用1 h；c)混合好標(biāo)記單克隆抗體和抗原后，在10 min內(nèi)各吸取100 μL稀釋好的患者標(biāo)本和對照血清至測試板上相應(yīng)的微孔中，37 ℃作用1 h；d)棄血清，用洗滌液重復(fù)洗滌6次，吸水紙上扣干，分別加100 μL上述作用好的登革病毒抗原和酶標(biāo)單克隆抗體復(fù)合物，37 ℃作用1 h；e)棄登革病毒抗原和酶標(biāo)單克隆抗體復(fù)合物，用洗滌液重復(fù)洗滌6次，吸水紙上扣干，每孔加入100 μL的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，室溫作用10 min充分顯現(xiàn)藍(lán)色后，每孔加入100 μL的終止液，混勻；f)在30 min內(nèi)于450 nm波長處讀取每孔的吸光度。

A.1.4 結(jié)果判斷

A.1.4.1 酶標(biāo)儀讀數(shù)結(jié)果判斷 判斷標(biāo)準(zhǔn)為：在NC/CO＜1且PC/CO＞1的情況下，若S/CO＜0.9，則結(jié)果為陰性，若S/CO＞1.1，則結(jié)果為陽性，若S/CO＝0.9～1.1，則標(biāo)本需重做。注：S為待檢血清的吸光度；NC為陰性對照血清的吸光度；PC為陽性對照血清的吸光度；CO為臨界較準(zhǔn)血清的吸光度平均值。

A.1.4.2 目測法 未加終止液前，在陽性對照血清為深藍(lán)色、陰性對照血清為無色的情況下，若樣品孔的顏色比臨界較準(zhǔn)血清孔深者為陽性，樣品孔的顏色比臨界較準(zhǔn)血清孔淺者為陰性。

A.1.5 意義 IgM抗體陽性，表示患者新近感染登革病毒，適用于登革熱早期診斷。

A.2 應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測登革病毒IgM抗體

A.2.1 原理 根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用純化的登革病毒基因工程表達(dá)抗原包被塑料板，與稀釋的待檢血清中的特異性抗體結(jié)合，其中血清IgM部分又與后加入的酶標(biāo)記的抗人IgM結(jié)合，通過酶與底物的作用產(chǎn)生可見的顏色反應(yīng)，顯色程度與特異性IgM抗體含量呈正相關(guān)。

A.2.2 材料和試劑 所需材料和試劑如下：a)洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫溫箱或水浴箱(37 ℃±2 ℃)；b)10～100 μL可調(diào)移液器、10 mL吸管；c)稀釋血清用的試管、吸水紙；d)蒸餾水或去離子水；e)登革病毒IgM抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。

A.2.3 檢測步驟 具體步驟如下：a)將檢測血清用樣品稀釋液做1∶50稀釋(先將10 μL血清加入到90 μL的樣品稀釋液中混勻，再將1∶10的稀釋血清用樣品稀釋液做1∶5稀釋充分混勻，標(biāo)本稀釋后應(yīng)在2 h內(nèi)使用)；b)將濃縮洗滌液加入720 mL(96T)蒸餾水中混勻備用；c)取出已包被板，加入已稀釋血清100 μL/孔，同時設(shè)陰、陽性對照及空白對照各2孔(陰、陽性對照孔分別直接加入相應(yīng)對照血清100 μL/孔，空白對照加入洗滌液100 μL/孔)，振蕩均勻后，于37 ℃水浴箱溫育40 min；d)溫育后，甩去板內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置1 min后甩干，重復(fù)洗滌5次，扣干；e)加入酶標(biāo)記物50 μL/孔(空白孔不加)，振蕩均勻后，于37 ℃水浴箱溫育30 min；f)溫育后，甩去板內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置1 min后甩干，重復(fù)洗滌5次，扣干；g)每孔加入底物A、B液各50 μL，37 ℃避光顯色10 min，再加入終止液50 μL/孔，于450 nm測OD值。

A.2.4 結(jié)果判斷 臨界值(cut-off)=0.2+陰性對照均值(N＜0.05時，按0.05計算)。樣品OD值大于臨界值為陽性，樣品OD值小于臨界值為陰性。樣品OD值在臨界值正負(fù)10%范圍內(nèi)為可疑，建議用其他方法復(fù)試。

A.2.5 意義 IgM抗體陽性，表示患者新近感染登革病毒，適用于登革熱早期診斷。

A.3 酶聯(lián)免疫法檢測登革病毒NS1抗原方法

A.3.1 原理 在微孔條上預(yù)包被登革病毒的單克隆抗體，該抗體可與登革熱病例血清中的登革病毒中的NS1抗原特異性結(jié)合，再與辣根過氧化酶標(biāo)記抗NS1抗體試劑進(jìn)行第二次溫育，當(dāng)樣品中存在登革病毒NS1抗原時將形成“包被抗體-NS1-酶標(biāo)抗體”復(fù)合物。加入顯色劑，復(fù)合物上連接的辣根過氧化物酶催化顯示劑反應(yīng)，生成藍(lán)色產(chǎn)物，終止反應(yīng)后，變?yōu)辄S色，若樣品中無登革病毒NS1抗原則不顯示。

A.3.2 材料 10 μL、100 μL、200 μL、1 mL移液器各一把；溫箱一臺，洗板機(jī)一臺，酶標(biāo)儀一臺。稀釋血清用的試管、吸水紙；蒸餾水或去離子水；登革病毒NS1抗原酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。

A.3.3 檢測步驟 具體步驟如下。a)將試劑盒在冰箱中取出，放置室溫平衡30 min，使用前將試劑輕輕振蕩混勻。b)配液：將試劑盒中濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋。c)編號：將樣品對應(yīng)微孔板編號，每板設(shè)陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔。d)加稀釋液：每孔加稀釋液50 μL，空白孔除外。e)加樣：分別在相應(yīng)孔加入待測樣品或陰陽性對照各50 μL，空白孔除外。f)溫育：用封板膜封板后，置37 ℃溫育60 min。g)每孔加酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，輕輕振蕩混勻。h)溫育：用封板膜封板后，置37 ℃溫育30 min。i)洗板：小心揭掉封板膜，用洗板機(jī)洗滌5遍，最后1次盡量扣干。j)顯色：每孔加入顯色劑A、B液各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。k)測定：每孔加終止液50 μL，10 min內(nèi)測定結(jié)果。設(shè)定酶標(biāo)儀波長于450 nm處[建議使用雙波長450 nm/(600～650)nm檢測]，用空白孔調(diào)零后測定各孔A值。

A.3.4 結(jié)果判定 臨界值計算：臨界值=0.10+陰性對照孔A值均值(陰性對照孔A值低于0.05者以0.05計算)。陰性對照的正常值范圍：陰性對照孔A≤0.1(若1孔A＞0.1應(yīng)舍棄，若兩孔或兩孔以上陰性對照＞0.1，應(yīng)重復(fù)實驗)。陽性對照正常值范圍：A≥0.8。陽性判定：樣品A值≥臨界值者為登革病毒抗原陽性。陰性判定：樣品A值＜臨界值者為登革病毒抗原陰性。

A.3.5 意義 陽性結(jié)果表示患者新近存在登革病毒感染，適用于登革熱早期診斷。

A.4 用免疫熒光法(FA/IFA)檢測登革病毒IgG抗體

A.4.1 原理 某些熒光素(常用異硫氰酸熒光素)能與抗體蛋白分子結(jié)合，而不喪失抗體活力，仍能和相應(yīng)的抗原發(fā)生特異免疫反應(yīng)，產(chǎn)生免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物由于有熒光色素的參與，在熒光顯微鏡下顯示熒光，表明有特異性抗原存在。直接免疫熒光法可用于檢測感染細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原，間接免疫熒光法可查待檢血清中的特異性抗體。

A.4.2 儀器與試劑 所需儀器與試劑如下：a)10～100 μL、100～1 000 μL可調(diào)移液器各1支；b)登革病毒1～4型抗原片(登革標(biāo)準(zhǔn)毒株感染BHK、Vero或C6/36細(xì)胞制備，低溫干燥保存)及相應(yīng)單克隆抗體(陽性對照)、陰性血清；c)羊抗人(兔抗人)IgG熒光抗體；d)待檢患者血清(急性期和恢復(fù)期)；e)常用稀釋液，pH 7.2～7.4 PBS、伊文斯蘭、封片膠等；f)熒光顯微鏡。

A.4.3 檢測步驟 具體步驟如下：a)取出抗原片，冷風(fēng)吹干；b)用pH 7.2～7.4 PBS稀釋待檢血清，從1∶20開始，對倍稀釋至所需稀釋度；c)用移液器依次從高稀釋度向低稀釋度逐個加入稀釋的待檢血清于四個型的登革病毒抗原片孔中，每型各加2孔待檢系列稀釋血清，血清量以完全覆蓋抗原面而不溢出孔外為準(zhǔn)，置濕盒內(nèi)，在37 ℃水浴孵育30 min(每次試驗同時作陰、陽性對照)；d)用pH 7.2～7.4 PBS漂洗3次，每次約30 s～1 min，再用蒸餾水洗1次，冷風(fēng)吹干；e)用pH 7.2～7.4 PBS稀釋熒光抗體，使其內(nèi)含2個工作單位和1∶8 000伊文斯蘭的熒光抗體，加入各孔中，使完全覆蓋抗原面，置濕盒中，37 ℃水浴作用30 min，取出，同上漂洗及吹干；f)用封片膠(或甘油緩沖液)封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

A.4.4 結(jié)果判斷 特異性熒光呈黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞漿中。根據(jù)熒光亮度和陽性細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占的比例可將熒光反應(yīng)大致區(qū)分為“+～++++”，無熒光者為“－”。檢測抗體滴度時，以特異熒光達(dá)“++”最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。A.4.5 意義 陽性結(jié)果只能說明受檢者可能曾存在登革病毒感染，但血清抗體效價達(dá)1∶80或以上者有診斷參考意義，若恢復(fù)期血清抗體效價比急性期血清抗體效價有4倍或以上增長可確診最近存在登革病毒感染。

A.5 中和試驗(NT)

A.5.1 原理 當(dāng)人體感染登革病毒后，血清中可產(chǎn)生保護(hù)性的中和抗體，登革病毒與這種特異性抗體作用后，能被特異性地“中和”，抑制登革病毒的復(fù)制與繁殖，使其失去感染能力。中和試驗包括動物中和試驗、組織培養(yǎng)中和試驗和空斑減少中和試驗三種，每種中和試驗又分為固定病毒稀釋血清法和固定血清稀釋病毒法兩種。

動物中和試驗由于需要特殊的感染動物房，一般的實驗室很難做到，所以更多的實驗室采用的是組織培養(yǎng)中和試驗和空斑減少中和試驗，其中空斑減少中和試驗比組織培養(yǎng)中和試驗更敏感、特異，但由于前者對操作技術(shù)的要求更高，而且病毒噬斑小，出斑時間長，對細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)基的要求也高，故一般實驗室多用的是組織培養(yǎng)中和試驗。

A.5.2 儀器與試劑 所需儀器與試劑如下。a)50～200 μL、1 mL可調(diào)移液器，200 μL、1 mL無菌吸頭。b)無菌細(xì)胞吹打管、吸管。c)無菌平底微量96孔組織培養(yǎng)板。d)無菌1.5 mL塑料離心管、冰盒。e)登革病毒1～4型標(biāo)準(zhǔn)毒株、C6/36細(xì)胞、陽性和陰性對照血清。f)CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡。g)生長液(200 mL)：Eagle’s MEM溶液174 mL，3%谷氨酰胺2 mL，1萬單位青鏈霉素2 mL，7.5%碳酸氫鈉2 mL，新生小牛血清20 mL，臨用前配制混勻。h)維持液的配制(200 mL)：Eagle’s MEM溶液190 mL，3%谷氨酰胺2 mL，1萬單位青鏈霉素2 mL，7.5%碳酸氫鈉2 mL，新生小牛血清4 mL，臨用前配制混勻。

A.5.3 檢測步驟

A.5.3.1 病毒滴度測定 具體步驟如下。a)病毒懸液制備與保存：將新鮮傳代收獲的登革病毒1～4型標(biāo)準(zhǔn)毒株的組織培養(yǎng)病毒懸液或乳小白鼠腦組織制備的病毒懸液，經(jīng)離心沉淀后吸出上清液，加入20%無抗體小牛血清后分裝于細(xì)胞凍存管，迅速放入﹣70 ℃以下冰箱保存。b)病毒接種：每型登革病毒各取出1小管冰凍的病毒，在冷水中迅速溶化，用維持液將各型病毒分別做10倍稀釋，從10-2到10-7，用無菌1.5 mL塑料離心管在冰盒上進(jìn)行。每個稀釋度病毒加4孔，每孔加50 μL，然后每孔加入C6/36細(xì)胞(濃度為1×106/mL)50 μL，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度33 ℃，濕度80%。每天觀察細(xì)胞病變，共觀察7 d，記錄觀察結(jié)果。c)TCID50的計算：根據(jù)細(xì)胞病變計算TCID50，見表A.1。

在這個例子中，能引起50%的組織培養(yǎng)板出現(xiàn)細(xì)胞病變的病毒稀釋度在10-5和10-6之間，計算如下：距離比例=(高于50%的細(xì)胞病變百分?jǐn)?shù)－50)÷(高于50%的細(xì)胞病變百分?jǐn)?shù)－低于50%的細(xì)胞病變百分?jǐn)?shù))=(83－50)÷(83－40)=0.7，距離比例與高于50%細(xì)胞病變稀釋度的對數(shù)相加即為TCID50(10-4.7)。由此得出100TCID50為10-2.7。A.5.3.2 組織培養(yǎng)中和試驗（固定病毒稀釋血清法） 具體步驟如下。a)將待測血清做系列倍比稀釋，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32……根據(jù)估計的血清效價決定稀釋倍數(shù)，用無菌1.5 mL塑料離心管在冰盒上進(jìn)行。b)將上述測定好的病毒稀釋成100TCID50/0.2 mL，用無菌1.5 mL塑料離心管在冰盒上進(jìn)行。c)將稀釋好的血清與稀釋好的病毒懸液各取等量混勻，用無菌1.5 mL塑料離心管在冰盒上進(jìn)行，置37 ℃水浴中作用1 h。d)在平底微量96孔組織培養(yǎng)板上，每個稀釋度病毒加4孔，每孔加50 μL，然后每孔加入C6/36細(xì)胞(濃度為1×106/mL)50 μL，置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度33 ℃，濕度80%。每天觀察細(xì)胞病變，共觀察7 d，記錄觀察結(jié)果。e)50%血清中和終點的計算。根據(jù)細(xì)胞病變計算50%血清中和終點，即能保護(hù)50%組織培養(yǎng)管不產(chǎn)生病變的血清稀釋度，計算方法見表A.2。

上述例子能保護(hù)50%的組織培養(yǎng)細(xì)胞孔不致細(xì)胞病變的血清稀釋度在1∶32～1∶64之間，具體計算如下：距離比例＝(50%－低于50%的病變率)÷(高于50%的病變率－低于50%的病變率)＝(50－20)÷(80－20)＝30÷60＝0.5，低于50%病變率血清稀釋度的對數(shù)＋距離比例乘稀釋系數(shù)的對數(shù)＝－1.5＋0.5×(－0.3)=－1.5＋(－0.15)=－1.65，－1.65的反對數(shù)＝1/45，即1∶45的血清可保護(hù)50%細(xì)胞不產(chǎn)生病變。

A.5.4 意義 中和試驗是登革病毒血清學(xué)診斷上最特異、最敏感的方法。既往感染過登革病毒的人在檢測不到HI抗體時也可檢出中和抗體。初次感染登革病毒可用中和試驗進(jìn)行登革病毒四種血清型別區(qū)分鑒定。恢復(fù)期血清中可見到相應(yīng)的單一型別反應(yīng)。第二或第三次感染，不能用中和試驗進(jìn)行血清型別鑒定。

表A.1 TCID50的計算

表A.2 50％血清中和終點的計算

A.6 應(yīng)用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測登革病毒IgG抗體

A.6.1 原理 根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，用純化的登革病毒基因工程表達(dá)抗原包被塑料板，與稀釋的待檢血清中的特異性抗體結(jié)合，其中血清IgG部分又與后加入的酶標(biāo)記的抗人IgG結(jié)合，通過酶與底物的作用產(chǎn)生可見的顏色反應(yīng)，顯色程度與特異性IgG抗體含量呈正相關(guān)。

A.6.2 材料與試劑 所需材料與試劑如下：a)洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、恒溫溫箱或水浴箱(37 ℃±2 ℃)；b)10～100 μL可調(diào)移液器、10 mL吸管；c)稀釋血清用的試管、吸水紙；d)蒸餾水或去離子水；e)登革病毒IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。

A.6.3 檢測步驟 具體步驟如下。a)將檢測血清用樣品稀釋液做1∶50稀釋(先將10 μL血清加入到90 μL的樣品稀釋液中混勻，再將1∶10的稀釋血清用樣品稀釋液做1∶5稀釋充分混勻，標(biāo)本稀釋后應(yīng)在2 h內(nèi)使用)。b)將濃縮洗滌液加入720 mL(96T)蒸餾水中混勻備用。c)取出已包被板，加入已稀釋血清100 μL/孔，同時設(shè)陰、陽性對照及空白對照各2孔(陰、陽性對照孔分別直接加入相應(yīng)對照血清100 μL/孔，空白對照加入洗滌液100 μL/孔)，振蕩均勻后，于37 ℃水浴箱溫育40 min。d)溫育后，甩去板內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置1 min后甩干，重復(fù)洗滌5次，扣干。e)加入酶標(biāo)記物50 μL/孔(空白孔不加)，振蕩均勻后，于37 ℃水浴箱溫育30 min。f)溫育后，甩去板內(nèi)液體，用洗滌液注滿各孔，靜置1 min后甩干，重復(fù)洗滌5次，扣干。g)每孔加入底物A、B液各50 μL，37 ℃避光顯色10 min，再加入終止液50 μL/孔，于450 nm測OD值。

A.6.4 結(jié)果判斷 臨界值(cut-off)=0.150+陰性對照均值(N＜0.05時，按0.05計算)。樣品OD值大于臨界值為陽性，樣品OD值小于臨界值為陰性。樣品OD值在臨界值正負(fù)10%范圍內(nèi)為可疑，建議用其他方法復(fù)試。A.6.5 意義 患者恢復(fù)期血清比急性期血清IgG抗體滴度有4倍及以上升高，可確診感染，單份血清檢測一般表明其曾存在登革病毒感染，但抗體滴度大于等于1∶320時，結(jié)合臨床表現(xiàn)及流行病學(xué)史，亦可確定為新近存在病毒感染。

附錄B

（規(guī)范性附錄）

登革熱病原學(xué)檢測方法

B.1 C6/36白紋伊蚊細(xì)胞分離登革病毒

B.1.1 原理 登革病毒是一種具有嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)存活的生物，必須生活在活的細(xì)胞組織內(nèi)，C6/36白紋伊蚊細(xì)胞對登革病毒十分敏感，根據(jù)觀察病毒對其產(chǎn)生的變化(病變等現(xiàn)象)和應(yīng)用特異、敏感的檢測技術(shù)，檢出病毒的存在和型別。

B.1.2 儀器與試劑 所需儀器與試劑如下。a)50～200 μL、1 mL可調(diào)移液器，200 μL、1 mL無菌吸頭。b)無菌細(xì)胞吹打管、吸管。c)無菌平底微量96孔/24孔組織培養(yǎng)板或細(xì)胞管。d)C6/36細(xì)胞。e)CO2培養(yǎng)箱、生物安全柜、倒置顯微鏡。f)生長液(200 mL)：Eagle’s MEM溶液174 mL，3%谷氨酰胺2 mL，1萬單位青鏈霉素2 mL，7.5%碳酸氫鈉2 mL，新生小牛血清20 mL，用前混勻。g)維持液的配制(200 mL)：Eagle’s MEM溶液190 mL，3%谷氨酰胺2 mL，1萬單位青鏈霉素2 mL，7.5%碳酸氫鈉2 mL，新生小牛血清4 mL，用前混勻。h)標(biāo)本處理液(100 mL)：Eagle’s MEM溶液90 mL，50 μg/mL慶大霉素100 μL，1 000 μg/mL兩性霉素B 1 mL和1 000 U/mL青鏈霉素1 mL，小牛血清2 mL，用7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至pH 7.2，用前混勻。

B.1.3 標(biāo)本的采集及處理 具體步驟如下。a)患者：無菌采集發(fā)病后5 d內(nèi)靜脈血3 mL，放冰壺送實驗室分離血清，接種組織細(xì)胞培養(yǎng)，不能及時接種的，將血清置﹣20 ℃保存。b)尸體標(biāo)本：可取血、腦脊液、腦組織、肝等。c)蚊：采集吸過血的埃及伊蚊，白紋伊蚊或其他可疑蚊種，用0.50 mol/L(10%)葡萄糖液喂養(yǎng)，至胃血完全消化后置﹣20 ℃，待死后按蚊種及捕獲地點分組，以10～20只一組為宜，經(jīng)生理鹽水沖洗數(shù)次后，轉(zhuǎn)入研磨器，加1 mL標(biāo)本處理液，研碎均勻，置預(yù)冷4 ℃的離心機(jī)上，10 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清液于4 ℃作用2 h處理后接種C6/36細(xì)胞。

B.1.4 病毒分離 C6/36(白紋伊蚊純系細(xì)胞株)傳代細(xì)胞長成單層后(在25 cm2細(xì)胞瓶、細(xì)胞管、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板等)，倒去細(xì)胞生長液換成細(xì)胞維持液，如果傳代后立即接種，可用細(xì)胞生長液，在25 cm2細(xì)胞瓶接種患者血清20 μL，細(xì)胞管和24孔細(xì)胞培養(yǎng)板各接種3 μL，蚊懸液或組織懸液根據(jù)濃度取接種量，加樣后適度混勻，置35 ℃、CO2培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)，觀察7 d，若細(xì)胞出現(xiàn)膨大至融合，折光度增強(qiáng)、顆粒增多等現(xiàn)象，取細(xì)胞懸液用熒光PCR檢測登革病毒核酸(不需提取病毒RNA)，若7 d后細(xì)胞不出現(xiàn)病變，需盲傳1～2代，仍不出現(xiàn)病變者經(jīng)核酸檢測，陰性者作陰性報告。

B.1.5 間接免疫熒光試驗(FA/IFA)鑒定登革病毒

B.1.5.1 試驗方法 具體步驟如下。a)細(xì)胞片的制備：把出現(xiàn)“++”病變的C6/36細(xì)胞管倒去維持液(若不出現(xiàn)病變，則需培養(yǎng)7 d再制片)，用pH 7.2 PBS洗2次后加PBS 3 mL，用滴管把細(xì)胞從管壁上吹下，吹散，2 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄去PBS，加0.2 mL PBS把沉渣吹散，滴加在10孔的載玻片各孔中，冷風(fēng)吹干，加冷丙酮固定10 min，用PBS沖洗2次，蒸餾水漂洗1次，冷風(fēng)吹干，﹣20℃保存。正常C6/36細(xì)胞對照按同法制片。b)試驗方法：取出保存的待鑒定細(xì)胞片或腦組織片，冷風(fēng)吹干，于各孔中按順序滴加4個型登革病毒使用單位的單克隆抗體，各型2孔，對照2孔滴加PBS，置濕盒內(nèi)37 ℃水浴30 min，取出用PBS沖洗3次，蒸餾水漂洗1次，冷風(fēng)吹干，滴加含130 μmol/L(1∶8 000)伊文思藍(lán)的2單位抗鼠IgG熒光抗體，置濕盒內(nèi)37 ℃水浴30 min，用PBS沖洗3次，蒸餾水漂洗1次，冷風(fēng)吹干，用甘油緩沖液封片，鏡檢，記錄結(jié)果。

B.1.5.2 結(jié)果判斷 特異性免疫熒光呈黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)，正常組織細(xì)胞被染成橙紅色或暗紅。

B.1.5.3 意義 從患者血液、組織或蚊媒中分離出登革病毒，可確診存在登革病毒感染，經(jīng)鑒定，可確定病毒型別。

B.2 應(yīng)用乳小白鼠分離登革病毒

B.2.1 原理 新生小白鼠對登革病毒十分敏感，根據(jù)觀察病毒對其產(chǎn)生的致病等現(xiàn)象和應(yīng)用特異、敏感的檢測技術(shù)，檢出病毒的存在和型別。

B.2.2 儀器和試劑 參考B.1.2。C6/36白紋伊蚊細(xì)胞改用1～3日齡乳小白鼠。

B.2.3 標(biāo)本采集及處理 見B.1.3。

B.2.4 病毒分離 每一標(biāo)本接種一窩1日齡～3日齡小白鼠，每只腦內(nèi)接種全血或1∶10血清或蚊懸液、組織懸液10～20 μL，接種后48 h內(nèi)死亡者作非特異性死亡，棄去。存活者觀察至10 d左右仍未發(fā)病時，剖取其中2只，取腦，用pH 8.0肉湯制成10%懸液，盲傳1～3日齡小白鼠一窩，其余的及盲傳的均觀察至第四周，未發(fā)病作陰性結(jié)果。在觀察期內(nèi)若發(fā)病(松毛、蜷縮、活動力降低、站立不穩(wěn)、抽搐、離群、不進(jìn)食、癱瘓等癥狀)則剖取半邊腦，按盲傳法制成10%鼠腦懸液，轉(zhuǎn)種1～3日齡小白鼠，并作無菌試驗，另一半腦置5.43 mol/L(50%)甘油緩沖液中低溫保存。無菌試驗陰性而仍出現(xiàn)以上癥狀的乳鼠作為可疑毒株傳代、保種，并進(jìn)行鑒定。

B.2.5 病毒鑒定 具體步驟和方法如下。a)腦組織片的制備：取發(fā)病瀕死的小鼠腦組織以冰凍切片制成10孔組織片，經(jīng)冷風(fēng)吹干，冷丙酮固定10 min，沖洗、吹干后放﹣20 ℃保存。正常腦組織同法制作。b)試驗方法、結(jié)果和意義：參考B.1.5。

B.3 RT-PCR技術(shù)檢測登革病毒RNA及型別鑒定

B.3.1 原理 PCR技術(shù)(聚合酶鏈反應(yīng))是利用雙鏈DNA分子堿基配對原則，在一定條件下擴(kuò)增DNA片段的體外擴(kuò)增方法。它的特異性取決于兩個人工合成的寡核苷酸引物的序列，引物與待擴(kuò)增片段兩條鏈兩段DNA序列分別互補(bǔ)，待擴(kuò)增DNA在變性溫度下分解為二條單鏈模板，在復(fù)性溫度引物與模板兩端的DNA序列分別復(fù)性(雜交-堿基配對)，在延伸溫度和單核苷酸存在的條件下，由TaqDNA聚合酶催化，引導(dǎo)引物的5′端向3′端方向延伸合成新鏈，是一個重復(fù)進(jìn)行的熱變性復(fù)性延伸的溫控循環(huán)過程，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，DNA產(chǎn)量呈指數(shù)上升，經(jīng)過20個循環(huán)以后，從微量基因材料，特異性地擴(kuò)增可達(dá)數(shù)百萬倍。登革病毒含RNA基因組，因此PCR前需經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶作用，合成第一條cDNA鏈(RT)，再進(jìn)行擴(kuò)增(PCR)，即RT-PCR。設(shè)計一對通用引物可擴(kuò)增登革病毒組基因。設(shè)計不同型登革病毒的引物對，可擴(kuò)增出不同的血清型病毒的基因產(chǎn)物。根據(jù)基因擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小可判斷是否登革病毒或某一型登革病毒。

B.3.2 設(shè)備和試劑

B.3.2.1 設(shè)備 移液器(10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)及配套吸頭、離心管(1.5 mL、0.2 mL)及管架、臺式高速離心機(jī)、普通冰箱、旋渦混合器、電泳儀及電泳槽、微波爐、PCR儀、紫外分析儀等。

B.3.2.2 試劑 隨機(jī)引物、登革病毒特異性引物、RNA提取試劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、10×Tris-硼酸(TBE)緩沖液(108 g Tris粉，9.3 g依地酸二鈉EDTA-Na2，55 g硼酸，完全溶解后用HCl調(diào)pH至8.0，加水至1 000 mL，用前稀釋成0.5倍或1倍)、加樣緩沖液(0.5%溴酚藍(lán)和體積比為40%的蔗糖溶于水后，分裝于4 ℃保存)、溴化乙錠(10 mg/mL，使用濃度為0.5 μg/mL)、瓊脂糖等。見表B.1。

B.3.3 檢測步驟

B.3.3.1 病毒RNA的提取 待檢標(biāo)本用RNA提取試劑提取病毒RNA，按照試劑說明進(jìn)行操作，制備模板RNA。

B.3.3.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 以隨機(jī)引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物，根據(jù)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)要求，按試劑說明書操作，以病毒RNA為模板合成cDNA。

B.3.3.3 登革病毒4種血清型通用引物的PCR擴(kuò)增 以D1和D2為引物，以隨機(jī)引物合成的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s，擴(kuò)增9個循環(huán)后，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、68 ℃ 30 s(每個循環(huán)增加10 s)，擴(kuò)增25個循環(huán)，68 ℃延伸10 min。

B.3.3.4 登革病毒型特異性引物的多重PCR擴(kuò)增 以TS1、TS2、TS3、TS4和D1為引物，以通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，多重PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 15 s、55 ℃

15 s、68 ℃ 30 s，擴(kuò)增10個循環(huán)后，94 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、68 ℃ 30 s(每個循環(huán)增加5 s)，擴(kuò)增10個循環(huán)，68 ℃延伸10 min。

B.3.4 結(jié)果判斷 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%～2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果條帶的分子量與預(yù)期片段大小相同，表明為相應(yīng)的登革病毒核酸擴(kuò)增陽性。

B.3.5 意義 此法可對早期病例登革病毒的檢測及分型鑒定，基因擴(kuò)增產(chǎn)物可進(jìn)一步進(jìn)行序列測定和分析。

B.4 TaqMan探針實時熒光PCR檢測登革病毒RNA

B.4.1 原理 登革病毒有四個血清型，根據(jù)四型登革病毒共有基因特定的序列，合成一對特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針。該探針與登革病毒特有的共同基因特異性結(jié)合，結(jié)合部位位于引物結(jié)合區(qū)域內(nèi)。探針的5′端和3′端分別標(biāo)記不同的熒光素，如5′端標(biāo)記FAM熒光素，它發(fā)出的熒光能夠被檢測儀器接收，稱為報告熒光基團(tuán)(用R表示)，3′端一般標(biāo)記TAMRA熒光素，它在近距離內(nèi)能吸收5′端報告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號，稱為淬滅熒光基團(tuán)(用Q表示，淬滅熒光基團(tuán)也可用一種基本無熒光本底的小溝結(jié)合物——MGB，取代了常規(guī)可發(fā)光的TAMRA熒光標(biāo)記，使得新探針技術(shù)的熒光本底大大降低，從而提高分辨率)。當(dāng)PCR反應(yīng)在退火階段時，一對引物和一條探針同時與目的基因片段結(jié)合，此時探針上R基團(tuán)發(fā)出的熒光信號被Q基團(tuán)所吸收，儀器檢測不到R所發(fā)出的熒光信號；當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時，Taq酶在引物的引導(dǎo)下，以四種核苷酸為底物，根據(jù)堿基配對的原則，沿著模板鏈合成新鏈；當(dāng)鏈的延伸進(jìn)行到探針結(jié)合部位時，受到探針的阻礙而無法繼續(xù)，此時的Taq酶發(fā)揮它的5′→3′外切核酸酶的功能，將探針?biāo)獬蓡魏塑账幔璧K，與此同時標(biāo)記在探針上的R基團(tuán)游離出來，R所發(fā)出的熒光再不為Q所吸收而被檢測儀所接收；在Taq酶的作用下繼續(xù)延伸過程合成完整的新鏈，R和Q基團(tuán)均游離于溶液中，儀器可繼續(xù)檢測到R所發(fā)出的熒光信號。

表B.1 登革病毒通用和血清分型引物

B.4.2 材料及方法

B.4.2.1 設(shè)備 移液器(10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL)及配套吸頭、離心管(1.5 mL、0.2 mL)及管架、臺式高速離心機(jī)、普通冰箱、旋渦混合器、實時熒光PCR儀等。

B.4.2.2 試劑 引物及探針(見表B.2)、RNA提取試劑、熒光RT-PCR試劑盒等。

B.4.3 檢測步驟

B.4.3.1 病毒RNA的提取 待檢標(biāo)本用RNA提取試劑提取病毒RNA，按照試劑說明進(jìn)行操作，制備模板RNA。

B.4.3.2 登革病毒4種血清型通用熒光PCR擴(kuò)增 用登革病毒通用引物和探針進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。以ABI 7500熒光PCR儀為例，反應(yīng)條件可根據(jù)使用的試劑說明進(jìn)行調(diào)整，如：42 ℃ 30 min，95 ℃10 min后，進(jìn)行45個循環(huán)的二步法PCR：95 ℃ 15 s→62 ℃ 40 s，熒光信號的收集設(shè)置在每次循環(huán)的退火延伸時進(jìn)行。

B.4.3.3 登革病毒4種血清型分型熒光PCR擴(kuò)增 分別以登革病毒4種血清型特異的引物和探針進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。以ABI 7500熒光PCR儀為例，反應(yīng)條件可根據(jù)使用的試劑說明進(jìn)行調(diào)整，如：42 ℃ 30 min，95 ℃ 10 min后，進(jìn)行45個循環(huán)的二步法PCR：95 ℃ 15 s→60 ℃ 60s，熒光信號的收集設(shè)置在每次循環(huán)的退火延伸時進(jìn)行。

B.4.4 結(jié)果判斷 以熒光PCR反應(yīng)的前3～15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，以本底信號標(biāo)準(zhǔn)差的10倍作為熒光閾值，標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)生的熒光信號達(dá)到熒光閾值時所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)為循環(huán)閾值(Ct值)，以Ct＜40、熒光信號數(shù)據(jù)線性化處理后對應(yīng)循環(huán)數(shù)生成的曲線圖呈“S”形的標(biāo)本可判斷為相應(yīng)的登革病毒核酸檢測陽性。

B.4.5 意義 此法為一種靈敏、特異、快速、低污染的登革病毒RNA檢測方法，可定性或定量檢測登革熱患者早期血清中的登革病毒。

附錄C

（資料性附錄）

登革熱的鑒別診斷

C.1 麻疹

發(fā)熱、咳嗽、流涕、結(jié)膜充血、畏光，口腔內(nèi)有Koplik斑，發(fā)熱第3天～第4天出現(xiàn)麻疹性皮疹。

C.2 風(fēng)疹

低熱、皮疹和耳后枕部淋巴結(jié)腫大，全身癥狀輕。

C.3 猩紅熱

發(fā)熱、咽峽炎、全身彌漫性鮮紅色皮疹和疹后脫屑，白細(xì)胞增多。

表B.2 引物及探針類型

C.4 流行性感冒

發(fā)熱、咳嗽，無皮疹，全身中毒癥狀較重，特別是短時間內(nèi)出現(xiàn)數(shù)量較多的相似患者。

C.5 基孔肯雅熱

發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛、白細(xì)胞減少等表現(xiàn)，但病情一般較輕，常發(fā)生對稱性小關(guān)節(jié)炎。鑒別主要有賴于核酸檢測、病毒分離和血清學(xué)試驗。

C.6 寨卡病毒病

發(fā)熱、皮疹、結(jié)膜炎、神經(jīng)系統(tǒng)損害等表現(xiàn)，可導(dǎo)致新生兒小頭畸形。鑒別主要有賴于核酸檢測、病毒分離和血清學(xué)試驗。

C.7 鉤端螺旋體病

有疫水接觸史，發(fā)熱、腓腸肌痛壓痛，淋巴結(jié)腫大，肝腎損害明顯，白細(xì)胞增多，鉤體血清學(xué)反應(yīng)陽性。

C.8 腎綜合征出血熱

有鼠類接觸史，發(fā)熱、充血出血、休克和急性腎功能損害等表現(xiàn)，白細(xì)胞增多，尿蛋白陽性，特異性IgM陽性。

C.9 恙蟲病

有草地接觸史，高熱、典型焦痂或特異性潰瘍，淋巴結(jié)腫大，抗生素治療有特效。

附錄D

（資料性附錄）

登革熱的病原學(xué)、流行病學(xué)及臨床表現(xiàn)

D.1 病原學(xué)

登革病毒歸屬于黃病毒科黃病毒屬。成熟病毒顆粒由核衣殼蛋白和脂質(zhì)膜蛋白形成一個立體結(jié)構(gòu)，直徑約為50 nm。登革病毒為RNA病毒，基因組由單股正鏈RNA組成，全長大約11 000個核苷酸，包括編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和和7個非結(jié)構(gòu)蛋白的基因，3個結(jié)構(gòu)蛋白為核衣殼蛋白C、膜相關(guān)蛋白M和包膜蛋白E，包膜蛋白E與病毒的血凝活性及中和活性有關(guān)。登革病毒可分為4種血清型：DEN-1，DEN-2，DEN-3和DEN-4，4種血清型登革病毒均可引起登革熱的發(fā)生和流行。

登革病毒對熱敏感。50 ℃ 30 min或54 ℃ 10 min、超聲波、紫外線、0.05%甲醛溶液、乳酸、高錳酸鉀、龍膽紫等均可滅活病毒。病毒在pH 7～9環(huán)境中最為穩(wěn)定，在﹣70 ℃或冷凍干燥狀態(tài)下可長期存活。在4 ℃條件下，患者急性期血清的感染性可保持?jǐn)?shù)周之久。

D.2 流行病學(xué)

D.2.1 傳染源 登革熱患者、隱性感染者、帶病毒的非人靈長類動物是登革熱的主要傳染源。

D.2.2 傳播途徑 主要是經(jīng)媒介伊蚊叮咬吸血傳播。在我國傳播媒介主要為白紋伊蚊和埃及伊蚊。

D.2.3 人群易感性 人群普遍易感，但感染后僅有部分人發(fā)病。感染登革病毒后，人體會對同型病毒產(chǎn)生持久的免疫，但對不同型病毒感染不能形成有效保護(hù)。再次感染不同型別登革病毒會引發(fā)非中和性交叉反應(yīng)抗體增加，引起抗體依賴性增強(qiáng)感染(antibody-dependent enhancement, ADE)，這是引起重癥登革熱機(jī)制的一個重要假設(shè)。

D.2.4 流行特征 登革熱流行于全球熱帶及亞熱帶地區(qū)，尤其是在東南亞、太平洋島嶼和加勒比海等100多個國家和地區(qū)。我國各省均有輸入病例報告，廣東、云南、海南、福建、廣西、浙江等南方省份可發(fā)生本地登革熱暴發(fā)或流行，登革熱在熱帶、亞熱帶地域可常年發(fā)病，在我國輸入病例常年存在，本地感染病例一般于夏秋季高發(fā)。

D.3 臨床表現(xiàn)

D.3.1 臨床分型 登革熱是一種全身性疾病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣。根據(jù)病情嚴(yán)重程度，臨床可分為普通登革熱和重癥登革熱兩種類型。

D.3.2 臨床分期

D.3.2.1 急性發(fā)熱期 登革熱的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，潛伏期1～14 d，一般5～9 d。其特征為突起發(fā)病，發(fā)熱是最常見的癥狀，24 h體溫可達(dá)39 ℃以上，一般持續(xù)3～7 d。部分病例于發(fā)熱3～5 d后，體溫降至正常1～3 d后再次升高，表現(xiàn)為“雙峰熱”。發(fā)熱時多伴頭痛，全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)痛，明顯乏力，可出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉、食欲不振等消化道癥狀。病程第3天～第6天全身出現(xiàn)充血性皮疹或點狀出血疹等，典型皮疹多見于四肢的針尖樣出血點及“皮島”樣表現(xiàn)。部分病例皮疹伴有皮膚瘙癢。部分患者可出現(xiàn)不同程度的出血表現(xiàn)，如皮下出血、注射部位瘀點瘀斑、牙齦出血、鼻衄及束臂試驗陽性等。D.3.2.2 極期 部分患者高熱持續(xù)不緩解，或退熱后病情加重，可因毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致明顯的血漿滲漏。嚴(yán)重者可發(fā)生休克及其他重要臟器損傷等。

極期通常出現(xiàn)在病程的第3天～第8天。

部分患者持續(xù)高熱，或熱退后病情加重，出現(xiàn)腹部劇痛、持續(xù)嘔吐等重癥預(yù)警指征往往提示極期的開始。極期可因全身毛細(xì)血管通透性增加導(dǎo)致球結(jié)膜水腫，四肢非凹陷型水腫，胸水、腹水、心包積液、膽囊壁增厚、低蛋白血癥等血漿滲漏表現(xiàn)，嚴(yán)重者可發(fā)生休克及重要臟器損傷等表現(xiàn)。

少數(shù)患者無明顯的血漿滲漏表現(xiàn)，但仍可出現(xiàn)嚴(yán)重出血包括皮膚瘀斑、嘔血、黑便、陰道流血、肉眼血尿、顱內(nèi)出血等。

D.3.2.3 恢復(fù)期 極期后的2～3 d，患者病情好轉(zhuǎn)，胃腸道癥狀減輕，進(jìn)入恢復(fù)期。部分患者可見針尖樣出血點，下肢多見，可有皮膚瘙癢。白細(xì)胞計數(shù)開始上升，血小板計數(shù)逐漸恢復(fù)。

多數(shù)患者表現(xiàn)為普通登革熱，可僅有發(fā)熱期和恢復(fù)期。少數(shù)患者發(fā)展為重癥登革熱。

D.4 重癥登革熱

D.4.1 重癥登革熱的高危人群 具體人群如下：a)老人、嬰幼兒和孕婦；b)伴有糖尿病、高血壓、冠心病、消化性潰瘍、哮喘、慢性腎病等基礎(chǔ)疾病者；c)伴有免疫缺陷病者。

D.4.2 早期識別重癥登革熱的預(yù)警指征 具體指征如下：a)退熱后病情惡化；b)嚴(yán)重腹部疼痛；c)持續(xù)嘔吐；d)昏睡或煩躁不安；e)明顯出血傾向(黏膜出血或皮膚瘀斑等)；f)血小板計數(shù)＜50×109/L；g)白蛋白＜35 g/L。

D.5 束臂試驗

又稱為毛細(xì)血管脆性試驗。在前臂屈側(cè)肘彎下4 cm處畫一直徑5 cm的圓圈，用血壓計袖帶束于該側(cè)上臂，先測定血壓，然后使血壓保持在收縮壓和舒張壓之間，持續(xù)8 min后解除壓力。待皮膚顏色恢復(fù)正常時，計數(shù)圓圈內(nèi)皮膚新的出血點數(shù)目。出血點超過10個為束臂試驗陽性。

本標(biāo)準(zhǔn)自2018年8月1日起施行，舊標(biāo)準(zhǔn)同時廢止。

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（下載日期：2018-03-30）