Nur77慢病毒表達載體的構建及在鼻咽癌CNE-2Z細胞中的穩定表達

王 建

在世界大部分地區，鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)是1種罕見的惡性腫瘤，但是在東南亞、北非和我國南方(尤其是廣東省)其發病率顯著增高，國內稱之為“廣東癌”[1]。鼻咽癌惡性程度較高，易于轉移且預后不良[2]。Nur77是1個孤兒核受體家族成員，參與調控多種惡性腫瘤的發生發展[3]。我們的前期研究發現微管相關蛋白與腫瘤的侵襲轉移密切相關[4]。為了探討Nur77在鼻咽癌轉移過程中的作用及機制，本研究構建綠色熒光蛋白標記的Nur77基因慢病毒表達載體并穩定轉染鼻咽癌CNE-2Z細胞，為后續實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

限制性內切酶(Thermo)；T4 DNA連接酶(Thermo)；DNA回收試劑盒(Magen)；KOD Plus DNA聚合酶(TOYOBO)；cloneez無縫重組試劑盒(金斯瑞)；質粒抽提試劑盒(康為)；LipofectaminTM3000(Invitrogen)；FItran：慢病毒包裝專用轉染試劑(輝駿生物)；Trypsin-EDTA(MP)；Polybrene(輝駿生物)；Pyrex?cloning cylinder(Sigma)。

1.2 質粒及細胞株

XL1-BLUE MRF'感受態細胞(輝駿生物)；慢病毒表達載體：pCDH-EGFP-G4S-MCS(輝駿生物)；慢病毒包裝質粒：pMD2.G、psPAX2(輝駿生物)；HEK293T及CNE-2Z細胞。

1.3 方法

1.3.1 制備目的基因片段 根據人Nur77全長序列設計引物，上游引物為：5'-AATGAATTCGAATGCCCTGTATCCAAGCCCAA -3'，含EcoRI酶切位點；下游引物為：5'-AATGGATCCTCAGAAGGGCAGCGTGTCCATG-3'，含BamHI酶切位點。PCR反應體系如下：上下游引物各1 μl(10 μmol/L)、模板cDNA 1 μl、KOD Plus DNA聚合酶0.5 μl、10×聚合酶buffer 2 μl、ddH2O 12.5 μl、dNTP 2 μl。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，共25個循環；68 ℃ 5 min。擴增后，經1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的片段。

1.3.2 構建重組表達載體 用EcoRI和BamHI酶切載體和片段，反應體系如下：10×buffer 6 μl、載體/基因片段10 μl、EcoRI酶 1 μl、BamHI酶1 μl、ddH2O 42 μl，于37 ℃酶切3 h，回收酶切后的質粒和基因片段；線性化質粒和基因連接，反應如下：基因片段2 μl、線性化載體3 μl、T4連接酶1 μl、10× T4 Buffer 2 μl、ddH2O 12 μl，16 ℃連接過夜。

1.3.3 轉化感受態細胞及菌落檢測 感受態細胞加入10 μl DNA混勻，冰浴30 min；轉化管于42 ℃循環水浴鍋中熱激90 s后冰浴3 min；每管加入500 μl SOC液體培養基，37 ℃振蕩培養1 h，使細菌復蘇；菌液涂抹培養基于37 ℃培養過夜；挑取單菌落置于液體培養基中，37 ℃搖菌；做菌落PCR檢測陽性克隆；挑取單菌落搖菌后抽提質粒，酶切驗證是否得到陽性克隆；陽性克隆送測序驗證。

1.3.4 慢病毒包裝及滴度測定 20 μl包裝質粒和4μg慢病毒表達質粒在400 μl 0.9%(w/v)生理鹽水中混合，并加入50 μl轉染試劑，室溫孵育20 min后加入到培養293T細胞的100 mm皿中；轉染后48 h和72 h分別收集上清，3 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清用0.45 μm微孔濾器過濾；離心管底鋪上2～4 ml 20%(w/v)蔗糖-PBS溶液,緩慢加入慢病毒上清液，50 000 g超速離心濃縮2 h，用250～500 μl PBS重溶；逐孔稀釋法進行慢病毒滴度測定。

1.3.5 建立穩定轉染細胞株 CNE-2Z細胞以2×104/孔接種至24孔板；取兩孔細胞分別加入25 μl的pCDH-EGFP-G4S-Nur77病毒液和pCDH-EGFP-G4S-MCS對照病毒液；感染48h后，于熒光顯微鏡下觀察感染效果；在6孔板中按20、50、100、200、500、1000接種感染細胞，培養7～12天后觀察克隆形成情況；鏡下將發光細胞群找到，用記號筆在培養皿底部劃定范圍做記號；用sigma公司克隆環套住記號筆畫圈范圍的克隆，向克隆環中加60～70 μl胰酶消化，傳到新的96孔板培養孔中培養；一周后觀察并標記單克隆孔；當單克隆孔長至孔面積的1/5時，選擇均為陽性(通過熒光判斷)的單克隆孔，消化再培養，長滿后移到24孔中繼續培養；Western blot進行穩定轉染細胞株的Nur77蛋白表達水平檢測。

2 結果

2.1 pCDH-EGFP-G4S-Nur77過表達載體的構建

以CNE-2Z細胞cDNA為模板的PCR產物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見大小約為1 700 bp的特異性擴增條帶，與預期一致(圖1)。菌落PCR及酶切鑒定選出陽性克隆，將以陽性克隆為模板擴增出的基因片段進行測序，目標基因序列進行同源性分析對比，同源性100%，表明重組質粒構建成功。

圖1 Nur77基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 慢病毒滴度測定

接種病毒48 h后觀察熒光表達情況，病毒原液的滴度值=熒光細胞個數/稀釋后的病毒量。實驗和對照病毒滴度均超過1×10-8Tu/ml。

2.3 過表達Nur77的穩轉CNE-2Z細胞株的建立及蛋白表達檢測

通過病毒感染及熒光篩選，獲得了穩定表達Nur77的細胞株。熒光顯微鏡觀察可見，發熒光的細胞與明場視野下細胞相一致(圖2)。Western blot結果顯示(圖3)，與轉染空載體組相比較，本底Nur77的蛋白水平無顯著差異，而融合蛋白在空載體組無表達而在Nur77組高表達，提示Nur77成功穩定轉染CNE-2Z細胞株。

圖2 穩定轉染細胞株的熒光顯微鏡觀察

圖3 轉染的CNE-Z細胞Western blot檢測

3 討論

Nur77是1個核轉錄因子，在細胞增殖、凋亡、遷移等多種生物學過程中發揮重要影響[5]。在腫瘤發生發展中，Nur77具有雙重作用。一方面，作為轉錄因子，其能上調多種基因表達促進細胞的增殖與遷移，抵抗凋亡；另一方面，其蛋白本身的亞細胞定位變化如定位到線粒體可誘導凋亡[6]。而我們的研究方向，是探討Nur77通過作用于微管蛋白調節鼻咽癌細胞遷移、侵襲的分子機制。因此，構建Nur77與熒光蛋白融合表達質粒穩定轉染鼻咽癌細胞株能更好的反映目的蛋白的亞細胞定位及與相關蛋白的相互作用。

質粒瞬時轉染的效率雖然高，但轉染后目的基因很少能整合進入基因組，因此不適合穩定株的篩選[7]。慢病毒載體是以人類免疫缺陷I型病毒(HIV-1)為基礎發展起來的基因載體。它是1種逆轉錄病毒，能使外源基因整合入宿主基因組并穩定、長期表達，但卻比一般的逆轉錄病毒具有更高的滴度和更廣的宿主范圍。攜帶外源基因的慢病毒載體與包裝載體同時轉染包裝細胞，即可進行病毒的包裝，而后經收集和濃縮的慢病毒液可以直接用于感染宿主細胞[8]。本研究成功構建了綠色熒光蛋白標記的Nur77慢病毒表達載體并穩定轉染CNE-2Z細胞，為進一步研究Nur77亞細胞定位改變及對微管功能的調控奠定了前期實驗基礎。