蓮子多糖分離純化的研究*

常青，彭暄

（福建農林大學食品科學學院，福建 福州 350002）

蓮子又稱蓮籽、蓮米、蓮肉、蓮蓬子，是睡蓮科植物蓮的成熟種子[1]。蓮子有四大品系，主要分布在我國的福建、湖北、湖南、浙江、江蘇、河北等地，有3000多年的種植歷史，其中以湖南湘蓮、福建建蓮、浙江衢蓮為上品，福建建寧和江西廣昌分別作為“中國建蓮之鄉”和“中國白蓮之鄉”[2]。多糖是一類由多個單糖基通過糖苷鍵結合的方式形成的天然大分子物質，是生物體內除核酸、蛋白質以外的又一類重要生物分子[3]。

多糖最常用的提取方法為水提醇沉法，此方法提取的多糖常常含有較多雜質（如蛋白、色素等），所以需要對提取得到的多糖進行分離純化[4]。為了能到達一個最佳的脫蛋白的效果，通常將酶法脫蛋白與sevag法脫蛋白聯用[5]。多糖的純化通常采用柱層析法，常用的凝膠填料有Sephadex和Sepharose兩種。陳嬋[6]采用水提法提取蓮子多糖，但是提取率較低，同時也發現超聲波對蓮子多糖的提取具有強化作用，微波對蓮子多糖的提取具有輔助作用。

但是超聲波微波提取的蓮子多糖分離純化工藝尚未見報道，因此本文主要研究超聲波微波提取的蓮子多糖分離純化工藝，通過酶法脫蛋白結合sevag法脫蛋白和經過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后冷凍干燥獲得純化的蓮子多糖。通過考察不同的酶解溫度（20、30、40、50、60、70 ℃）、酶解時間（40、50、60、70、80、90 min）、酶添加量（80、100、120、140、160 U/mL），得到蛋白酶酶解的最佳工藝，通過sevag法對酶法脫蛋白后的多糖進一步脫蛋白，得到sevag法脫蛋白的最佳工藝。將脫蛋白后的蓮子多糖過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱，用全波段紫外-可見光光譜掃描，對純化后的多糖進行純度鑒定。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶，索萊寶生物科技有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍染液、正丁醇、苯酚、葡萄糖、濃硫酸、氯仿、氯化鈉等均為國產分析純；DEAE-52纖維素、Sephadex G-20葡聚糖凝膠為美國Sigma公司；實驗用水為蒸餾水。

1.2 主要儀器

DHL-A恒流泵：上海金朋分析儀器有限公司；

UV-1100型紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；

丹瑞HH-4型數顯恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；

恒溫水浴搖床：尤尼柯（上海）儀器有限公司；

玻璃層析柱（Φ16mm×400mm）：上海精科實業有限公司。

2 試驗方法

2.1 蓮子多糖的制備

取適量去心干蓮子于植物粉碎機中粉碎，過40目篩，得蓮子粉末樣品。取5 g蓮子粉末，置于鹵素快速水分測定儀中測定粉末樣品的水分含量，所制得蓮子粉末的水分含量小于3%。取蓮子粉末樣品于錐形瓶，按液料比55 mL/g的比例加入二次蒸餾水，在超聲波功率110 W和微波功率110 W的條件下提取70 s，樣品浸提液離心（4000 r/min，20 min）得濾液，加入4倍體積的常溫無水乙醇，室溫下靜置沉降20 h后，再次離心（4000 r/min，20 min）。棄上清液，取沉淀，用二次蒸餾水溶解沉淀后冷凍干燥，得蓮子多糖。

2.2 多糖含量的測定

以葡萄糖為標準品，采用硫酸-苯酚比色法來測定蓮子多糖[7]。

標準曲線溶液的配制：分別配制8、16、24、32、40 g/mL的葡萄糖溶液，分別吸取不同濃度的葡萄糖標準液2 mL，依次加入濃度為6%的苯酚1.0 mL，濃硫酸5.0 mL，顯色后于冷水中冷卻15 min，在波長490 nm處測定吸光度值，空白對照用蒸餾水做試劑空白。

實驗結果得到的標準曲線：

表明在0～0.08 mg/mL范圍內葡萄糖溶液濃度與吸光度OD值呈現良好的線性關系。

X--表示葡萄糖溶液濃度，單位mg/mL；

Y--表示吸光度OD值。

2.3 蛋白質含量的測定

牛血清蛋白標準曲線溶液的配制[8,9]：采用考馬斯亮藍法進行顯色測定，以牛血清白蛋白為標準品，分別配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL牛血清白蛋白標準溶液，取1 mL加到試管中。加入考馬斯亮藍染液5.0 mL，混勻后室溫下靜置3 min，以試劑空白作對照，在波長595 nm處測定吸光值。

樣品的測定：配制1 mg/mL的蓮子多糖溶液，吸取樣品液1.0 mL按照標準曲線測定的步驟測定吸光值，計算樣品蛋白質的濃度。

牛血清蛋白標準曲線方程為y=0.0066x+0.0092，R2= 0.9994。表明濃度在0～0.1 mg/mL的范圍內牛血清蛋白溶液的濃度與吸光度值的線性關系良好（見圖1）。

2.4 脫蛋白試驗

2.4.1 酶法脫蛋白

2.4.1.1 單因素試驗

取蓮子多糖粉末0.5 g，用蒸餾水溶解，定容至500 mL，以蛋白質的脫除率為指標，考察不同的酶解溫度（20、30、40、50、60、70℃）、酶解時間（40、50、60、70、80、90 min）、酶添加量（80、100、120、140、160 U/mL）蛋白酶對蛋白質脫除率的影響。

2.4.1.2 正交試驗

在單因素實驗結果的基礎上，以蛋白質脫除率為指標，綜合考慮酶解溫度（A）、酶解時間（B）、酶添加量（C）對除蓮子多糖中蛋白質的脫除率的影響。

2.4.2 Sevag法

Sevag試劑的配制：將氯仿和正丁醇按照4∶1的比例配制。

取酶解脫蛋白后的蓮子多糖樣品液30 mL，加入10mL的Sevag試劑，用恒溫水浴搖床振蕩（200 r/min）20～30 min，離心（4000 r/min）20 min，取少量上清液測定蛋白質和多糖的含量，然后將溶液反復處理5次。按公式計算多糖損失率和蛋白脫除率。

M1：脫蛋白后的多糖含量（mg）

M2：脫蛋白前的多糖含量（mg）

C1：脫蛋白后的蛋白質濃度（mg/mL）

C2：脫蛋白前的蛋白質濃度（mg/mL）

2.5 DEAE-52纖維素柱分級

參照Zeng等[10]的方法進行稍加修改，將預處理后的DEAE-52纖維素填裝于1.6 cm×60 cm的層析柱中，柱高40 cm。用去離子水配制濃度為30 mg/mL蓮子多糖溶液，取10 mL加入DEAE-52纖維素柱上層析分級。0～19管用蒸餾水洗脫、20～120管用0～1 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速：30 mL/h，4 mL/管。

2.6 Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱分級蓮子多糖

將預處理好的Sephadex G-20葡聚糖凝膠填裝于1.6 cm×40 cm的層析柱中，柱高30 cm。將DEAE-52纖維素柱分離的組分單次上樣10 mL，樣品濃度30 mg/mL。用NaCl溶液（0.1 mol/L）洗脫，流速：20 mL/h，每管4 mL，總共收集80管。用苯酚-硫酸法測定，在490 nm處用紫外-可見分光光度計隔管測吸光度值后，作洗脫曲線。收集吸收峰部分的蓮子多糖，洗脫液氯化鈉用透析法除去，將透析后的蓮子多糖溶液濃縮冷凍干燥，即得分離的組分。

2.7 紫外-可見光譜掃描分析

分別取脫蛋白后和過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖5 mg用蒸餾水溶解后定容至100 mL，用紫外-可見光譜進行全波段掃描，掃描波長間隔為0.5 nm。

3 結果與分析

3.1 蓮子多糖脫蛋白試驗

3.1.1 酶法脫蛋白

3.1.1.1 單因素實驗

3.1.1.1.1 不同酶解溫度對蓮子多糖蛋白質脫除率的作用

從圖2可知，溫度在20～50 ℃范圍內，隨著酶解溫度的升高，蛋白脫除率不斷上升，這可能是因為溫度升高，酶的活力增大，酶解速度加快[11]；當溫度高于50℃時，蛋白脫除率呈下降趨勢。這可能是因為當溫度超過酶的最適溫度后，酶蛋白質發生變性，酶的活力下降，酶解速度下降[12]。因此，酶解溫度選擇50℃。

圖2 酶解溫度對蛋白質脫除率的作用

3.1.1.1.2 不同酶解時間對蓮子多糖蛋白脫除率的作用

從圖3可知，當酶解時間為40～60 min 時，蛋白質脫除率不斷上升，60 min后蛋白脫除率幾乎不變。這可能是因為隨著酶解反應時間的增加，酶與底物接觸充分，蛋白質脫除率增大，反應時間太短，酶解不充分[13]；當時間達到一定時，底物濃度降低，酶反應達到飽和，蛋白的脫除效果受酶解時間的作用不大[14]。因此，最佳酶解時間為60 min。

圖3 酶解時間對蛋白脫除率的作用

3.1.1.1.3 不同酶添加量對蓮子多糖蛋白脫除率的作用

從圖4可知，當酶添加量在80～120 U/mL范圍時，蛋白質脫除率隨著酶添加量的增加而增加；當酶添加量超過120 U/mL時，蛋白質脫除率呈現下降趨勢。這可能是因為多糖溶液中的蛋白質，作為蛋白酶的作用底物，隨著酶濃度的增加，酶反應速率加快，蛋白質脫除效果不斷上升[15]；但是當酶濃度升高到一定程度時，蛋白酶的酶解底物不足，酶反應速率降低[5]。因此，最適酶添加量為120 U/mL。

圖4 酶量對蛋白脫除率的作用

3.1.1.2 正交優化試驗

3.1.1.2.1 因素水平表

在上述實驗的基礎上，以蛋白質脫除率為指標，綜合考慮酶解溫度、酶解時間、酶添加量對蛋白質脫除率的影響，使用SPSS13.0統計軟件對正交實驗結果進行分析處理。根據單因素試驗結果設計3因素、3水平的正交試驗表（表1）。

3.1.1.2.2 蓮子多糖脫蛋白最佳工藝條件的確定

蛋白酶酶法脫蛋白正交試驗結果見表2。

由表2可知，比較Rj值得大小，RC＞RB＞RA，即在所設定的因素中，C因素對蛋白質脫除的作用最大，其次是B因素，A因素。對正交試驗進行直觀分析，將K值進行比較可知，A2B3C2為優水平組合，即酶解溫度為50 ℃，酶解時間為70 min，木瓜蛋白酶添加量為120 U/mL時，蛋白質的脫除率最大。

表1 正交試驗因數和水平表

表2 正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

由表3可知，B和C因素作用顯著，A因素作用不顯著，所以需對酶解時間B和酶添加量C因素的各水平進行多重比較。

多重比較的結果以B1、B3和C2為最好，根據實際情況，B因素選擇B1，由于A因素不顯著，故根據實際情況A因素選擇第1水平，由方差分析和多重比較可得出優方案為A1B1C2。由于與正交試驗中的優水平組合不一致，需做進一步的驗證實驗，進一步的驗證試驗的結果為：組合A1B1C2蛋白質的脫除率為74.25%，由驗證試驗的結果可得此次試驗的最優方案為A1B1C2，此時，多糖的損失率為5.88% 。

表4 B因素各水平均值多重比較

表5 C因素各水平均值多重比較

3.1.2 Sevag法脫蛋白

經蛋白酶處理后的蓮子多糖，采用sevag法做進一步的處理，蛋白質脫除率和多糖損失率情況如圖5所示。

圖5 Sevag試劑處理結果

從圖5可知，sevag法脫蛋白2次后，蛋白質脫除率到達最大，多糖損失率不斷上升。綜上，最佳方案為sevag法脫蛋白2次，此時蛋白質脫除率和多糖損失率分別為85.5%和7.5%。

3.1.3 最佳工藝的確定

蓮子多糖的最佳脫蛋白工藝為：酶解溫度50 ℃、酶解時間50 min、木瓜蛋白酶添加量120 U/mL，此時蛋白質脫除率和多糖的損失率分別為74.25%和5.88%。再用sevag試劑處理2次，此時蛋白質脫除率為85.5%，多糖損失率為7.5%。

3.2 蓮子多糖的梯度洗脫

蓮子多糖經DEAE-52纖維素柱線性洗脫分級得到單一組分LSPs-1（如圖6所示），這與陳嬋[6]的結果一致。將35-58管收集經透析、濃縮和冷凍干燥后得到純化后的蓮子多糖，經測定該組分的回收率為90.18%，說明蓮子多糖已基本洗脫出來。

采用Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析對經DEAE-52纖維素柱純化后蓮子多糖作進一步的分離純化試驗。經DEAE-52纖維素柱純化后的單一組分用Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線如圖7所示，經透析、濃縮和冷凍干燥后得到更純的蓮子多糖LSPs-1-1。

圖7 蓮子多糖P1的Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱層析洗脫曲線

3.3 純度鑒定

從圖8可知，脫蛋白后的蓮子多糖在280 nm處無明顯的吸收峰，相比脫蛋白前的蓮子多糖吸收峰小得多，說明經過酶法和sevag法脫蛋白后蓮子多糖中的蛋白質已基本被除凈。

圖8 脫蛋白前后紫外-可見光譜全波段掃描圖

圖9 過柱后紫外-可見光譜全波段掃描圖

從圖9可以看出，經過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖在280 nm處無蛋白質吸收峰，說明經過DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱后的蓮子多糖已經沒有蛋白質，此時的蓮子多糖是一個純的蓮子多糖。這與陳嬋[6]的研究結果一致，陳嬋用DEAE-SephadexA-25分離蓮子多糖后得到一個組分，經Sephrose CL-4B凝膠層析和聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析得到蓮子多糖為純品。

4 結論

⑴采用蛋白酶酶解和sevag試劑處理后，得到蓮子多糖的酶法脫蛋白最佳工藝為：酶解溫度為50 ℃、酶解時間為50 min和木瓜蛋白酶添加量為120 U/mL，在此工藝條件下，蛋白質脫除率和多糖的損失率為74.25%和5.88%。經sevag試劑處理2次后，此時蛋白質脫除率為85.5%，多糖損失率為7.5%。

⑵采用DEAE-52纖維素柱和Sephadex G-20葡聚糖凝膠柱對蓮子多糖進行純化，純度鑒定采用紫外-可見光譜掃描法，結果表明，此分離純化的方法能得到單一組分蓮子多糖，該多糖組分均無蛋白質和核酸的吸收峰，說明該法能得到純度較高的多糖。