多氯聯苯暴露促進HepG2細胞脂質的生成

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(濟南大學 生物科學與技術學院，山東 濟南 250022)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是指由非酒精性因素引起的，以肝細胞內脂質過量蓄積為主要特征的臨床病理綜合征[1]，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及肝硬化，至今其發病機制尚未完全闡明[2-4]。據報道，肝脂肪蓄積是由肝內甘油三酯(triglycerides, TG)的消除和合成機制發生改變引起的，這一過程涉及眾多分子，如過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)、固醇調節元件結合蛋白(SREBP-1c)等。PPARα可通過β-氧化參與脂質的消除，而SREBP-1c則參與其合成途徑。

多氯聯苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)屬于持久性有機污染物，是由氯化聯苯的異構體組成的一類含氯有機化合物，被應用于各生產領域[5]，由于其物化性質穩定，因此對全球造成了污染。 PCB156作為一種多氯聯苯單體(2, 3, 3′, 4, 4′, 5-多氯聯苯)，廣泛存在于人類生態環境中。如劉耕耘等[6]檢測北京土壤中PCBs組成時，發現土壤中存在PCB156；韓景超等[7]研究浙江溫州不同城市功能區徑流中PCBs的污染特性時，檢測到不同徑流中含有多種PCBs，其中包括PCB156。近年來，多項研究[8-9]顯示PCBs暴露能增加部分人患NAFLD的風險。本課題組前期研究[10]發現，2, 3, 7, 8-四氯二苯并二口惡英(TCDD)與多氯聯苯混合物Aroclor1254聯合暴露可使小鼠肝臟積累大量脂肪顆粒，且肝臟病理切片顯示有大量的空泡形成和炎性細胞的浸潤等病理特征，然而，PCB156的毒性作用及其作用機制尚不明確[11]。

HepG2細胞作為體外實驗模型，其病變過程僅局限于單純脂肪變性，是研究NAFLD脂肪變性的良好模型[12]。本文中以HepG2細胞作為體外實驗模型，考察PCB156暴露與NAFLD的關系，并探討其潛在分子作用機制，希望對有效減緩PCBs暴露導致人體健康危害具有指導的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

主要材料包括：HepG2細胞株，中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供；多氯聯苯單體PCB156，北京百靈威科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶及最小必需培養基(MEM)，美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司；磷酸緩沖液(PBS)、細胞級二甲亞砜(DMSO)，北京索萊寶科技有限公司；核糖核酸(RNA)提取試劑盒、反轉錄試劑盒及熒光定量試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司；多聚甲醛(分析純)及油紅O，上海和序生物科技有限公司；甘油三酯(TG)測試盒、總蛋白測試盒，江蘇省南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及處理

HepG2細胞用體積分數為10%的FBS的MEM，于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中進行培養。 待細胞長至直徑為60 mm的培養皿容積的85%時，加胰蛋白酶(625個酶單位)進行消化，按細胞數密度5×104mL-1接種至24孔板，每個孔接種700 μL。待鋪板細胞貼壁約60%，分別用濃度為3.4、34 μmol/L的PCB156加入到生長狀態良好的HepG2細胞中進行暴露，以DMSO暴露作為對照組，每組設置3個平行試樣，均暴露72 h。

1.2.2 油紅O染色

取0.5 g油紅O溶于100 mL異丙醇中制成儲存液，實驗時取6 mL加蒸餾水至10 mL，靜置過濾配成工作液。 暴露實驗完成后，24孔板HepG2細胞用PBS(濃度為10 mmol/L)洗滌3遍，甲醛固定30 min，油紅O工作液染色20 min，用異丙醇體積分數為60%的溶液洗滌3遍，分色至背景無色，蒸餾水洗至脫去浮色后于倒置相差顯微鏡下觀察。

1.2.3 甘油三酯及總蛋白測定

按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.4 基因表達量實時熒光定量測試

PCB156暴露72 h后，收集各組細胞，按試劑盒說明書分別提取各實驗組細胞總RNA，并將總RNA逆轉錄成互補脫氧核糖核酸(cDNA)。參考文獻并用Primer 5軟件設計β-肌動蛋白(β-actin，內參)、PPARα、SREBP-1c引物序列(見表1)，進行熒光定量聚合酶鏈式反應(Q-PCR)，反應條件如下： 95 ℃，3 min預變性；95 ℃，30 s變性；56 ℃，30 s退火；72 ℃，30 s延伸；72 ℃，10 min終延伸；4 ℃保溫；共35個循環，使用2-ΔΔCt法計算基因表達量。

表1 β-actin、PPARα、SREBP-1c引物序列

1.2.5 統計學分析

采用GraphPad Prism統計軟件進行數據處理，多個樣本均數的比較采用單因素方差分析，2個樣本均數的比較采用t檢驗(顯著性水平p≤0.05為顯著性差異)。

2 實驗結果

2.1 PCB156暴露促進HepG2細胞脂質的生成

油紅O作為一種強染脂劑，能夠指示細胞中脂質的含量，因此本文中對PCB156暴露72 h后的HepG2細胞進行油紅O染色。 實驗結果表明，濃度為3.4 μmol/L的PCB156暴露組相對于DMSO對照組，其HepG2細胞內脂滴數量明顯多于對照組(見圖1(a)(b)。 當暴露濃度為34 μmol/L時，HepG2細胞內脂滴數量顯著多于對照組(見圖1(c)(d))。

(a)對照組CT-0.1(放大倍數400×)(b)實驗組PCB156-3.4(放大倍數400×)(c)對照組CT-1(放大倍數400×)(d)實驗組PCB156-34(放大倍數400×)CT-0.1—對照組二甲亞砜的濃度為 0.1 μmol/L; PCB156-3.4—PCB156暴露濃度為3.4 μmol/L;CT-1—對照組二甲亞砜的濃度為1 μmol/L; PCB156-34—PCB156暴露濃度為34 μmol/L。圖1 多氯聯苯PCB156暴露后HepG2細胞內脂質蓄積

2.2 PCB156暴露增加HepG2細胞內甘油三酯的濃度

PCB156暴露增加HepG2細胞甘油三酯濃度的實驗結果如圖2所示。 與對照組相比，濃度分別為3.4、34 μmol/L的PCB156暴露均能增加HepG2細胞中TG的濃度(3.4 μmol/L時為1.18倍，34 μmol/L時為1.23倍)，但是顯著性水平p>0.05，不具有統計學差異。

2.3 PCB156暴露誘導HepG2細胞PPARα與SREBP-1c基因的表達

為了進一步探討PCB156促進HepG2細胞脂質生成的潛在分子機制，考察了PCB156暴露對HepG2細胞中參與脂質生成過程中重要調控基因PPARα與SREBP-1c的表達水平的影響，結果如圖3所示。 從實驗結果可以看出，相對于對照組，濃度為 3.4 μmol/L 的 PCB156 暴露 HepG2 細胞，能顯著上調PPARα(2.2倍，p<0.05)與SREBP-1c(2.4倍，p<0.05)基因的表達水平。

CT-0.1—對照組二甲亞砜的濃度為 0.1 μmol/L；PCB156-3.4—PCB156暴露濃度為3.4 μmol/L；CT-1—對照組二甲亞砜的濃度為1 μmol/L；PCB156-34—PCB156暴露濃度為34 μmol/L。圖2 多氯聯苯PCB156暴露增加HepG2細胞甘油三酯濃度的實驗結果

(a)PPARα

(b)SREBP-1cCT-0.1—對照組二甲亞砜的濃度為 0.1 μmol/L；PCB156-3.4—PCB156暴露濃度為3.4 μmol/L。圖3 過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARα)與固醇調節元件結合蛋白(SREBP-1c)基因表達量

3 分析與討論

NAFLD是一種主要受遺傳與環境相互作用調節的多因素疾病[12]。 本文中探討了環境中持久性有機污染物PCB156與NAFLD的關系。 實驗結果發現，PCB156暴露能夠促進HepG2細胞脂質的生成。

PCB156作為一種類二口惡英多氯聯苯，其結構與二口惡英的平面結構相似，具有與二口惡英比較相近的毒平面結構，因此具有與二口惡英比較相近的毒性作用。Duval等[13]研究發現，長期低劑量二口惡英暴露C57BL6小鼠能夠加劇小鼠NAFLD病變。Boucher等[14]研究證明，類二口惡英多氯聯苯PCB126暴露同樣能夠促進高脂喂養的C57/BL6小鼠NAFLD的發病進程。在本文的研究中，PCB156暴露能夠增加HepG2細胞內脂滴的數量和甘油三酯的濃度，具有導致NAFLD的風險，進一步驗證了類二口惡英多氯聯苯與NAFLD的相關性。

PCB156促進肝細胞脂質生成的作用機制通常與肝細胞脂質代謝紊亂有關。文獻[15]中的研究結果表明，脂質代謝紊亂與PPARα分子信號通路激活密切相關，且經過體內外實驗證實，PPARα的活化[16]可以促進肝臟甘油三酯的合成，導致肝臟脂肪病變。SREBP-1c作為調控肝臟脂質代謝的關鍵因子，能夠激活脂肪酸和膽固醇的生物合成，抑制TG的轉運[17-19]。Shimano[20]研究發現，SREBP-1c直接參與脂肪酸和TG合成的表達調控是參與脂肪合成的主要調節因子。McPherson等[21]認為SREBP-1c的過表達可引起脂肪合成相關酶基因的表達量過大，導致脂肪在非脂肪組織中堆積。在本文的研究中發現，PCB156暴露能夠顯著誘導PPARα和SREBP-1c信使核糖核酸(mRNA)的表達，表明PPARα和SREBP-1c在PCB156引起的NAFLD中起著潛在重要的調控作用。

PPARα、SREBP-1c作為NAFLD進程中重要的調控分子，其表達量的增加使細胞內TG蓄積，從而引發NAFLD進程。在PCB156誘導NAFLD發病進程中，關于PPARα、SREBP-1c等信號通路分子機制的問題還有待進一步研究，以期為治療NAFLD提供新思路。