春砂仁中總黃酮提取工藝的優(yōu)化

鐘旭美，陳銘中，姚 菲

（陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，廣東陽江 529566）

春砂仁（Amomum villosum Lour.）是著名的“四大南藥”之一，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有行氣、止痛、化濕開胃、健脾消脹、安胎止嘔的功能[1-2]；作為食品原材料，在調(diào)味品香辛料和保健食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[3-5]。廣東省陽春市產(chǎn)陽春砂仁最為著名，稱為道地南藥春砂仁，也為主流的商品藥材，在廣西、福建、四川等地也有引種[6-8]。黃酮類化合物是一類在植物界中分布廣泛、具有多種生物活性的多酚類化合物，是春砂仁的有效成分之一，具有抑菌、降壓、抗氧化等多種藥理作用[9]。試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑提取法，對(duì)春砂仁中的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取[10]，探究春砂仁中總黃酮提取工藝優(yōu)化，以槲皮苷為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取物中總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定[11-12]，以期得到簡易可行的工藝方法，為陽春市的春砂仁產(chǎn)業(yè)的精深加工提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

春砂仁，購于陽江市藥房；槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、氯化鋁，均為分析純。

DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FS250Y-3型粉碎機(jī)，廣州雷邁機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FA2204B型電子天平，上海精科美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；I3型紫外可見分光光度計(jì)，濟(jì)南海能儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總黃酮提取工藝

干燥春砂仁→粉碎后過40目篩→取樣→加入甲醇提取→過濾→分離提取物→成品[13]。

1.2.2 槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（1）吸收曲線測(cè)定。精密稱取干燥的槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)品11.2 mg，配制槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.112 mg/mL，吸取0.4 mL置于10 mL容量瓶，加5%AlCl31 mL，搖勻，放置5 min，加甲醇至刻度，搖勻后放置5 min，以甲醇試劑作為空白參比，用紫外分光光度法于波長400～450 nm處掃描，得到槲皮苷溶液吸收曲線。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密吸取槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別置于 10 mL容量瓶，加5%AlCl31 mL搖勻，放置5 min，加甲醇至刻度，搖勻后放置5 min，以甲醇試劑作為空白參比，用紫外分光光度計(jì)，根據(jù)吸收曲線得出的最大波長處測(cè)定吸光度，得到槲皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]，總黃酮得率由提取液槲皮苷含量計(jì)算。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

（1）甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g春砂仁粉，選擇料液比為1∶40，分別加入體積分?jǐn)?shù)為40%，50%，60%，70%，80%，90%的甲醇，提取溫度70℃，回流提取時(shí)間1 h，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，平行試驗(yàn)3次。

（2）提取時(shí)間對(duì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g春砂仁粉，選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶40，提取溫度70℃，分別提取30，60，90，120，150，180 min，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，平行試驗(yàn)3次。

（3）提取溫度對(duì)提取率的影響。準(zhǔn)確稱取1.00 g春砂仁粉，選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶40，分別在提取溫度40，50，60，70，80，90℃的條件下提取1 h，測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率，平行試驗(yàn)3次。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計(jì)自變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析優(yōu)化提取條件，考查甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度和提取時(shí)間這3個(gè)因素之間的交互作用，確定最佳提取水平[15]，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.5 數(shù)據(jù)處理

曲線繪制與單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5軟件處理作圖，響應(yīng)面方法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 吸收曲線

標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收曲線見圖1，槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

根據(jù)圖1的吸收曲線，得到槲皮苷的最大吸收波長為415 nm。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收曲線

圖2 槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以槲皮苷質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、波長415 nm處的吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制槲皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y=0.170 2X-0.001 1，R2=0.999 7。試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，吸光度與槲皮苷質(zhì)量濃度間的線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

甲醇體積分?jǐn)?shù)70%～90%，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，春砂仁總黃酮的提取率逐漸升高，在甲醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)總黃酮提取率最高，所以選擇體積分?jǐn)?shù)90%的甲醇為宜。

甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響見圖4。

由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間小于120 min時(shí)，春砂仁總黃酮的提取量逐漸增加，當(dāng)提取溫度超過120 min時(shí)，春砂仁總黃酮的提取率開始下降，因此選擇提取時(shí)間為120 min最適宜。

2.2.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響

提取溫度對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響

由圖5可知，在整個(gè)提取過程中，隨著提取溫度的升高，春砂仁總黃酮的提取率不斷增加。當(dāng)提取溫度低于80℃時(shí)，隨著提取溫度的延長，總黃酮提取率快速增加。這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長，總黃酮逐漸被浸提出來。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，總黃酮提取率的增加趨勢(shì)逐漸減緩，這是由于隨著提取時(shí)間的延長，大部分總黃酮被提取出來，提取效率降低。因此，80℃為適宜的提取溫度。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素的基礎(chǔ)上，選取甲醇體積分?jǐn)?shù)（A）、提取時(shí)間（B） 和提取溫度（C） 3個(gè)因素和3個(gè)水平，通過Design Expert軟件Box-Behnken組合設(shè)計(jì)，以春砂仁總黃酮提取率為響應(yīng)值，對(duì)春砂仁總黃酮的提取進(jìn)行優(yōu)化。

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，響應(yīng)面方法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果見表2，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表3，各因素交互作用對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響見圖6。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

利用Design Expert 8.0.6軟件，對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸擬合分析，得到春砂仁總黃酮提取率（Y）對(duì)A，B和C的二次多項(xiàng)回歸方程：

由表3可以看出，一次項(xiàng)A，C對(duì)總黃酮提取率的影響均達(dá)到了極顯著水平；二次項(xiàng)A2，C2，達(dá)到極顯著水平；交互項(xiàng)AC，BC達(dá)到了顯著水平；模型極顯著 （p=0.000 8），失擬項(xiàng) （p=0.086 2＞0.05）不顯著，說明模型是合理的，模型決定系數(shù)R2為0.951 7，校正決定系數(shù)R2Adj為0.889 6，說明該模型擬合結(jié)果良好，能較好地反映春砂仁總黃酮提取率與甲酵體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間和提取溫度的關(guān)系。

表2 響應(yīng)面方法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析

由圖6可知，各因素對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響，以甲醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度均極明顯，表現(xiàn)為曲線較陡，而提取時(shí)間的影響相對(duì)較小，表現(xiàn)為曲線較為平滑，同時(shí)圖6（b） 圖6（c） 的等高線橢圓形狀明顯，說明甲醇體積分?jǐn)?shù)與提取溫度、提取時(shí)間與提取溫度的交互作用較大，這與回歸方程的方差分析結(jié)果相一致。

2.4 最優(yōu)工藝預(yù)測(cè)與驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面分析結(jié)果，甲醇浸提法提取春砂仁總黃酮的最佳工藝條件為提取時(shí)間100.91 min，提取溫度73.18℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)85.38%。在此條件下春砂仁總黃酮提取率為11.20%。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法得到結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化的提取條件進(jìn)行甲醇浸提法提取春砂仁總黃酮的試驗(yàn)。考慮到實(shí)際操作情況，將試驗(yàn)條件修正為提取時(shí)間101 min，提取溫度73℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)85%。在此條件下測(cè)試3次，春砂仁總黃酮的平均提取率為11.11%，實(shí)際值與理論值較相近，可見該模型可以較好地反映各因素對(duì)春砂仁黃酮提取率的影響，同時(shí)也證明了用該方法研究春砂仁黃酮提取的可行性。

圖6 各因素交互作用對(duì)春砂仁總黃酮提取率的影響

3 結(jié)論

試驗(yàn)從成本和操作簡易的角度設(shè)計(jì)和優(yōu)化提取工藝，重點(diǎn)對(duì)甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到春砂仁總黃酮提取的最佳條件為提取時(shí)間101 min，提取溫度73℃，甲醇體積分?jǐn)?shù)85%。在此條件下，春砂仁總黃酮的提取率為11.11%。試驗(yàn)建立了良好的春砂仁總黃酮提取工藝，對(duì)春砂仁的綜合利用和精深加工提供參考。