光照強度CO2體積分數和氮源質量濃度對小球藻干質量積累的影響

黃冬麗，王福彬，吳柳芬

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124）

0 引言

小球藻 （Chlorella spp） 為綠藻門 （Chlorop Hyta） 小球藻屬（Chlorella） 球形單細胞淡水藻類，是地球上最早的生命之一，其細胞內光合作用色素豐富，因此具有較強的光合作用生產能力[1]。已有研究表明，小球藻細胞內含有豐富的多糖、蛋白質、色素、維生素、礦物質等，被廣泛應用于食品加工、醫療保健、環境保護、基因工程等行業，一直以來都是研究熱點。胡月薇[2]在研究中發現蛋白核小球藻粉對小鼠吞噬細胞活性有重要影響；紀雁[3]在研究中發現小球藻通過光合作用在味精廢水處理中發揮重要功能；魏文志[4]在研究中發現小球藻蛋白在預防腫瘤中發揮重要作用。

多種環境因素，如光照強度、溫度、pH值、CO2體積分數、氮源質量濃度等都能對小球藻的生長產生影響，其中光照強度、氮源質量濃度和CO2體積分數對小球藻生長起著尤為重要的作用[5-6]。光照強度和CO2體積分數主要影響小球藻的光合作用，而氮源主要影響小球藻生物量的積累[2]。試驗通過設置不同梯度的光照強度、氮源質量濃度和CO2體積分數，并采用標準曲線法求出藻細胞干質量，通過藻細胞干質量的積累量對小球藻的生長效果進行評估，以期為小球藻培養條件的優化研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要材料與試劑

蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa），購自中國科學院武漢水生生物研究所，所選用的培養基是經過改良的f/2培養基。

f/2培養基的配方：CH4N2O（尿素） 0.5 g/L，K2HPO40.04 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，FeCl3·6H2O 0.036g/L，Na2CO30.02g/L，EDTA0.001g/L，C6H8FeNO7（檸檬酸鐵銨） 0.006 g/L，微量元素A5溶液1 mL，pH值7.5。

A5 溶液：H3BO42.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.81 g/L，ZnSO40.222 g/L， Na2MoO40.39 g/L， CuSO4·5H2O 0.079 g/L，CO（NO3）2·6H2O 0.049 g/L，所有試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

YXQ-LS-100SII-01-00型立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司產品；GEN10S型紫外可見分光光度計，賽摩飛世爾科技（中國）有限公司產品；AR224CN型電子天平，常州奧豪斯儀器有限公司產品；DG-9146A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司產品；TES 1332A型照度計（中國臺灣）；MD-SYJ型照明設備，中山市歐普照明有限公司產品；氣體質量流量計，北京首科實華自動化設備有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制

根據培養基的配方準確稱取試驗藥品，先配制成母液，待試驗時將母液混合稀釋后經高壓滅菌即可制成微藻培養基。

1.2.2 培養條件

培養溫度25±1℃，光暗周期12 h/12 h，CO2體積分數用氣體流量計控制。

1.2.3 標準曲線的繪制

取指數生長末期的藻液1 L，稀釋至5個不同質量濃度后于波長680 nm處測OD值，然后將每個質量濃度的樣品平均分成3份，用真空抽濾泵將其抽濾到玻璃纖維膜上，然后放入電熱鼓風干燥箱中于105℃條件下烘干至恒質量。稱質量后減去玻璃纖維膜的質量即得樣品干質量。取3份樣品的平均值即為該質量濃度下樣品的干質量，并結合樣品體積，計算其細胞干質量（mg/mL）。以OD680為X軸、藻細胞干質量為Y軸，繪制藻細胞干質量標準曲線。

（1）小球藻細胞干質量的標準曲線。

蛋白核小球藻細胞干質量-OD680標準曲線見圖1。

2 結果與分析

2.1 光照強度對小球藻細胞干質量積累的影響

在培養溫度25℃，CO2體積分數15%，氮源質量濃度0.5 g/L的條件下，只改變光照強度為2.5×103，5.0×103，7.5×103lx，對小球藻進行光照培養。每隔24 h對小球藻進行取樣測吸光度并通過標準曲線求出其細胞干質量，并對結果進行分析。

光照強度對小球藻細胞干質量積累的影響見圖2。

圖2 光照強度對小球藻細胞干質量積累的影響

在光照強度為5×103lx時，小球藻的細胞干質量積累量最高。由圖2可知，在小球藻生長前期，光照強度對小球藻干質量的積累影響不明顯，不同強度光照下的小球藻細胞干質量差距不明顯；隨著細胞生長進入對數生長期，光照強度對小球藻細胞干質量的積累的影響顯著增加，不同強度光照下的小球藻細胞干質量差距明顯拉大[8]。對比圖2中數據可以發現，小球藻在光照強度為7.5×103lx時的生長狀況沒有光照強度為5.0×103lx時好，表明過強的光照反而會抑制小球藻的生長。

2.2 CO2體積分數對小球藻細胞干質量積累的影響

在培養溫度25℃，光照強度5.0×103lx，氮源質量濃度0.5 g/L的條件下，通過氣體流量計控制CO2體積分數為5%，10%，15%，20%，對小球藻進行光照培養。每隔24 h對小球藻進行取樣測吸光度，并通過標準曲線求出其細胞干質量，并對結果進行分析。

CO2體積分數對小球藻細胞干質量積累的影響見圖3。

圖3 CO2體積分數對小球藻細胞干質量積累的影響

在CO2體積分數為15%時，小球藻的細胞干質量積累量最高。由圖3可知，4種不同體積分數的CO2條件下，CO2體積分數15%時生長的小球藻干物質積累量顯著高于其他3種。初始3 d內，4種培養條件下的小球藻干質量積累增長較慢，此時小球藻可能處于潛伏生長期[9]。在4～6 d時，小球藻生長旺盛，干質量迅速積累，CO2體積分數15%培養條件下的小球藻細胞干質量積累量明顯高于其他3種。當CO2體積分數達到20%，小球藻在對數生長期的細胞干質量積累量明顯低于其他3種，說明CO2體積分數過高反而會抑制小球藻的生長。

2.3 氮源質量濃度對小球藻細胞干質量積累的影響

在控制培養溫度為25℃，CO2體積分數為15%，光照強度為5.0×103lx，只改變氮源質量濃度為0.5，1.0，1.5 g/L，對小球藻進行光照培養。每隔24 h對小球藻進行取樣測吸光度，通過標準曲線求出其細胞干質量，并對結果進行分析。

氮源質量濃度對小球藻細胞干質量積累的影響見圖4。

圖4 氮源質量濃度對小球藻細胞干質量積累的影響

在氮源質量濃度為0.5 g/L時，小球藻的細胞干質量積累量最高。由圖4可知，隨著氮源質量濃度的升高，小球藻的細胞干質量的積累逐漸減少，這表明氮源質量濃度過高不利于小球藻的生長。在初始的3 d內，3種氮源質量濃度下的小球藻細胞干質量相差不大，說明氮源濃度對處于潛伏生長期的小球藻干重積累影響不大[10]；在4～6 d時，小球藻進入對數生長期，此時需要合成大量蛋白質，故此時氮源質量濃度對小球藻的生長影響較大，在氮源質量濃度為0.5 g/L時的小球藻干質量積累量要明顯高于其他2種條件。

3 討論

光照強度、氮源質量濃度和CO2體積分數對小球藻的生長具有重要影響。其中光照強度和CO2體積分數主要影響小球藻的光合作用，而氮源質量濃度主要影響小球藻蛋白質的合成，這些因素的改變都會引起細胞干質量發生變化，因此研究利用細胞干質量的變化來反映小球藻的生長狀況。

光照不僅是小球藻光合作用所必須的條件，而且調節小球藻的整個生長發育過程，以便小球藻能更好地適應外界環境。光照強度通過影響小球藻對無機碳的親和力間接對小球藻的生長發揮作用，而藻類細胞中無機碳的積累和運輸都需要能量的驅動，能量的來源與光系統Ⅰ中的電子流密切相關。研究中通過對光照條件的控制，來探討光照強度對小球藻細胞生長的影響。結果表明，在一定的范圍內，適當地增加光照強度對小球藻的生長有促進作用；但當光照強度達到最適值5.0×103lx后，再增加光照強度，反而會引起小球藻細胞內無機碳的相對耗竭，從而抑制微藻的生長[10]。

CO2參與小球藻的光合作用過程，通過碳同化途徑變成有機物，從而使小球藻細胞干質量增加。CO2體積分數主要通過影響小球藻光合作用過程CO2濃縮機制中對無機碳的利用間接影響小球藻生長發育。研究中通過控制CO2的體積分數來對小球藻的生長條件進行探討。結果表明，在合適的范圍內，適當增加CO2體積分數有利于小球藻生物量的積累，導致藻細胞干質量明顯增加；但是當CO2體積分數達到最適值15%時，再提高CO2體積分數反而會導致小球藻對無機碳的親和力下降，對小球藻的生長不利[12]。

氮源是小球藻蛋白質合成過程中的重要原料，不同質量濃度的氮源會影響小球藻的蛋白質合成，間接影響小球藻的生長發育。研究中選用尿素作為氮源，通過控制尿素的質量濃度來對小球藻的生長條件進行探討。結果表明，在3種氮源培養條件下，氮源質量濃度為0.5 g/L時最利于小球藻生物量的積累，而高質量濃度的氮源會導致培養基的pH值升高，從而會抑制小球藻的生長[13]。

4 結論

在小球藻的培養過程中，光照強度5.0×103lx，CO2體積分數15%，氮源質量濃度0.5 g/L時有利于促進小球藻的生長和對無機碳的利用，使小球藻細胞干質量的積累量增加。研究通過對不同培養條件下小球藻細胞干質量的測量，從而對小球藻的生長狀況進行評估，并從中選出合適的光照強度、CO2體積分數和氮源質量濃度，以期為今后小球藻培養條件優化的相關研究提供參考依據。

[參]考文獻：

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[4]紀雁.利用味精廢水培養普通小球藻以及養藻廢水的生物強化處理 [D].濟南：山東大學，2014.

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