小麥醇溶蛋白糖基化改性過程中有害產物形成的影響因素分析

李 普，劉貴梅，盧永翎，鄭鐵松，呂麗爽*

（南京師范大學金陵女子學院，江蘇 南京 210097）

目前世界小麥產量為每年6億 t左右，而我國是小麥生產大國，隨著小麥畝產量和種植面積的增加，小麥總產量逐年增加。小麥谷朊蛋白是小麥加工淀粉的副產物，最早由意大利科學家Beccari從小麥粉中洗出來[1]。醇溶蛋白占小麥谷朊蛋白的40%～50%[2]，主要為面團提供黏性和延展性，這一特性使其可用作食用膜[3]或作為添加劑加入面包中提高面包的品質[4]。由于小麥醇溶蛋白結構中非極性氨基酸組分較多，使得其在水中的溶解性很小[5]，限制了在食品中的應用。為了進一步拓展小麥谷朊蛋白的應用范圍，國內外研究學者通常通過改性的方法提高植物蛋白的功能特性。糖基化改性以其安全性高、改性效果顯著的特點被廣泛應用。

當前用于糖基化改性的糖有：多糖（如葡聚糖、淀粉等）、雙糖（如麥芽糖等）、單糖（如葡萄糖、果糖等）。牛麗亞等[6]用葡聚糖作糖基供體，通過糖基化反應對小麥胚芽蛋白改性，其溶解性得到改善；孔繁惠等[7]用葡萄糖、D-麥芽糖、β-環糊精作糖基供體對玉米醇溶蛋白進行糖基化改性，同樣玉米醇溶蛋白的接枝度和溶解性得到明顯改善；王成波[8]用葡萄糖對玉米谷蛋白進行糖基化改性，其溶解性、乳化性和起泡性以及泡沫穩定性均得到一定程度的改善。

目前諸多研究表明糖基化改性行之有效，且對蛋白質的功能活性有很大的提高，然而，蛋白質與糖改性過程中，由于發生美拉德反應，會產生一系列的有害中間產物（如甲基乙二醛（methyl glyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO））和終產物（晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs））。GO可以引起DNA病變[9]，會抑制細胞中DNA的合成，引起線粒體功能紊亂，導致內皮細胞形態發生改變[10]；MGO通過產生凋亡物質誘導細胞死亡，誘導調節細胞生存和增殖的生長因子改變[11]，且能抑制蛋白質、DNA、RNA在絨毛細胞、隱窩細胞和結腸細胞中的形成[12]。AGEs可以與膠原蛋白和晶狀體蛋白等組織蛋白結合，改變蛋白質的結構和構象，引起一系列病變[13]，從而促進動脈粥樣硬化的形成[14]，引起白內障和視網膜病[15-16]，導致機體出現老化或者與老化有關的疾病[17]，加速生物個體衰老[18]等。目前國內外對糖基化改性過程中有害產物的檢測及控制鮮見報道。大量研究表明，黃酮、酚酸等天然產物可以減少或抑制糖基化過程中有害產物的形成。Wu等[19]研究表明木犀草素、蘆丁、（-）-表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、槲皮素對MGO誘導產生的AGEs有明顯的抑制作用；Sang Shengmin等[20]研究了EGCG、根皮素、根皮苷[21]、染料木素[22]對等MGO的抑制機理，發現這4 種物質均能捕獲MGO形成加合產物，從而進一步抑制AGEs的產生。以上報道均在模擬生理條件下研究其抑制活性；但是，在食品加工或改性條件下的抑制功效尚有待進一步驗證。

本研究以醇溶蛋白為對象，采用氣相色譜法（測定MGO和GO含量）和熒光光譜法（λex/λem＝340 nm/465 nm，測定AGEs含量）探究不同因素（糖種類、葡聚糖質量濃度和改性溫度、時間）對糖基化改性過程中有害產物MGO/GO和AGEs產生的影響，在醇溶蛋白改性體系中，選擇兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和半胱氨酸（cysteine，Cys）等天然產物，篩分有效抑制劑；并考察了添加抑制劑對改性蛋白乳化性的影響。以期為小麥蛋白糖基化改性的工業化生產提供有效的理論支持和安全保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥醇溶蛋白由南京師范大學食品生物技術實驗室自制；MGO（40%水溶液）、GO（40%水溶液）、衍生化試劑鄰苯二胺、槲皮素 美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷（分析純） 南京化學試劑有限公司；甲醇（色譜純）、葡萄糖、Cys、GSH、2,3-丁二酮均為分析純 上海國藥集團化學試劑有限公司；兒茶素、蘆丁、染料木素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、木樨草素 南京廣潤生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7820氣相色譜系統（柱溫箱、H P-5色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）、FID檢測器） 美國安捷倫公司；Infinite 200Pro多功能酶標儀 瑞士Tecan有限公司；QL-861微型漩渦混合儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；FA2104N電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C數字式pH計 上海三信儀表廠；UV1600紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司；T18高速勻漿機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 醇溶蛋白的制備與蛋白含量的測定

參考文獻[23]方法，稱取小麥谷朊粉100 g，加入10 倍體積的體積分數70%的乙醇溶液，磁力攪拌提取2 h后，10 000 r/min離心20 min，取上清液。將上清液減壓旋轉蒸發濃縮，濃縮液用去離子水透析（透析袋截留分子質量12～14 kDa）24 h后，改用體積分數0.1%的醋酸溶液透析24 h，溶出小分子的谷蛋白，再用去離子水透析24 h至中性，冷凍干燥，得到醇溶蛋白。

采用雙縮脲法測定蛋白含量。1）標準蛋白溶液的配制：用0.05 mol/L的NaOH溶液配制質量濃度為0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液；2）雙縮脲試劑的配制：取1.5 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）和6.0 g的酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O）溶于500 mL蒸餾水中，在攪拌下加入300 mL質量分數10% NaOH溶液，用水稀釋至1 000 mL；3）取1 mL不同質量濃度的標準蛋白液于不同的試管中，每個試管中分別加入4 mL雙縮脲試劑，37 ℃水浴20 min，冷卻至室溫，用可見光分光光度計測定其在540 nm波長處的吸光度。以牛血清白蛋白溶液的質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標作標準曲線。配制質量濃度為2 mg/mL的醇溶蛋白溶液測定其吸光度，同上操作測定醇溶蛋白含量。

1.3.2 氣相色譜法檢測MGO/GO的含量

以2,3-丁二酮為內標，鄰苯二胺為衍生化試劑，采用共衍生化方法（參照前期研究建立的方法[24]）測定體系中MGO/GO的含量。

1.3.3 熒光分光光度法檢測樣品中AGEs的含量

取樣品1 mL，15 000 r/min離心20 min，取0.3 mL上清液測定λex/λem＝340 nm/465 nm處相對熒光值，所有試樣均做3 組平行。

1.3.4 影響醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs形成的因素分析

1.3.4.1 糖種類的影響

用0.05 mol/L、pH 11.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）分別溶解醇溶蛋白和糖類。在8 支10 mL樣品管中各加入2 mL質量濃度為6 mg/mL的醇溶蛋白溶液，并分別加入1 mL質量濃度為12 mg/mL的麥芽糊精、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、木糖和阿拉伯糖溶液，加入PBS至6 mL。每組樣品在100 ℃水浴中加熱30 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應。然后以8 000 r/min離心30 min，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，并于-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一種糖做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節和1.3.3節所述方法檢測MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.2 葡聚糖質量濃度的影響

在4 支10 mL樣品管中各加入2 mL質量濃度為6 mg/mL的醇溶蛋白溶液，分別加入0.5、1.0、2.0、4.0 mL質量濃度為12 mg/mL的葡聚糖溶液，加入PBS至6 mL。同1.3.2節和1.3.3節步驟測定樣品中檢測MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.3 改性反應溫度的影響

用0.05 mol/L、pH 11.0的PBS分別溶解醇溶蛋白和葡聚糖。取4 支10 mL樣品管各加入2 mL質量濃度為6 mg/mL的醇溶蛋白溶液、1 mL質量濃度為12 mg/mL的葡聚糖溶液，加入PBS至6 mL。在80、90、100 ℃沸水浴，110 ℃油浴下加熱30 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應。然后以8 000 r/min離心30 min后，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一溫度做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節和1.3.3節所述方法檢測MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.4 改性反應時間的影響

用0.05 mol/L、pH 11.0的PBS分別溶解醇溶蛋白和葡聚糖。在7 支10 mL樣品管中各加入2 mL 6 mg/mL的醇溶蛋白溶液、1 mL 12 mg/mL的葡聚糖溶液，加入PBS至6 mL。在100 ℃沸水浴中分別加熱0、5、10、20、30、60、120 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應。然后以8 000 r/min離心30 min后，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一溫度做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節和1.3.3節所述方法檢測MGO/GO和AGEs含量。

1.3.4.5 改性條件下MGO/GO和AGEs天然抑制劑的篩選

用0.05 mol/L、pH 11.0的PBS分別溶解醇溶蛋白和葡聚糖。在40 支10 mL樣品管中各加入2 mL 6 mg/mL醇蛋白、1 mL 12 mg/mL葡聚糖溶液和10 種不同體積（0.05、0.10、0.50、1.00 mL）抑制劑，包括6 mmol/L兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素甲醇溶液，6 mg/mL GSH、Cys PBS（0.05 mol/L、pH 11.0）溶液，再加入PBS至6 mL。樣品在100 ℃水浴中加熱30 min后立即放入冰浴中冷卻5 min終止反應。然后以8 000 r/min離心30 min，取2 mL上清液加入2 mL甲醇，并于-80 ℃冷凍貯藏。以PBS代替糖溶液作空白組，同一種糖做3 組平行。樣品解凍并離心（8 000 r/min，10 min）除蛋白后，分別按照1.3.2節和1.3.3節所述方法檢測MGO/GO和AGEs含量。

1.3.5 抑制劑對改性醇溶蛋白乳化性能的影響

1.3.5.1 樣品制備

根據1.3.4.5節的結果，選擇濃度為0.5 mmol/L的染料木素、蘆丁和質量濃度為0.5 mg/mL的Cys、GSH作為抑制劑。同1.3.4節方法，100 ℃沸水浴中加熱30 min進行蛋白改性，分別制備添加和不添加抑制劑的改性醇溶蛋白，將所得蛋白樣品冷凍干燥。

1.3.5.2 乳化性測定

分別取原醇溶蛋白、改性醇溶蛋白、添加抑制劑的改性蛋白樣品于0.1 mol/L、pH 7.0的PBS中，使得蛋白終質量濃度為2 mg/mL，將6 mL樣品溶液和2 mL大豆油放入離心管中，高速勻漿1 min，立即從勻漿液底部吸取50 μL，加入到5 mL質量分數0.1%的十二烷基硫酸鈉溶液中，混勻后在500 nm波長處測定吸光度A0，代入下式計算乳化活性，以質量分數0.1%十二烷基硫酸鈉溶液作為空白對照，每個樣品進行3 次平行實驗，取平均值。

式中：ρ為蛋白質量濃度/（g/mL）；φ為光徑（1 cm）；θ為大豆油質量分數（0.25%）；100為稀釋倍數；A0為乳狀液在0 min時的吸光度。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2010、SPSS 17.0軟件分析實驗數據，采用Duncan’s多重比較法進行顯著性檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 醇溶蛋白含量

用雙縮脲法測定的牛血清白蛋白的質量濃度（橫坐標）與各質量濃度蛋白在540 nm波長處的吸光度（縱坐標）繪制標準曲線，線性回歸方程為：y＝0.047 8x+0.009 2（R2＝0.998 3）。通過標準曲線測定制備所得的醇溶蛋白含量為95%。

2.2 MGO和GO含量

以MGO質量濃度為橫坐標，MGO與內標峰的面積之比為縱坐標，MGO的質量濃度在0～20 μg/mL范圍內與峰面積呈現良好的線性關系。測得MGO的線性回歸方程為：y＝0.063 7x+0.010 6（R2＝0.999 2）。以GO質量濃度為橫坐標，GO與內標峰的面積之比為縱坐標，GO的質量濃度在0～20 μg/mL范圍內與峰面積呈現良好的線性關系。測得GO的線性回歸方程為：y＝0.062 5x+0.002（R2＝0.999 3）。

2.3 糖種類對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

圖 1 糖種類對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 1 Effect of sugar type on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

目前用于蛋白糖基化改性的既有單糖也有多糖。為了研究不同糖對醇溶蛋白改性過程中產生MGO/GO和AGEs的影響，選擇五碳糖（木糖、阿拉伯糖）、六碳糖（果糖、葡萄糖）、多糖（麥芽糊精、葡聚糖、淀粉）和二糖（蔗糖）進行實驗。由圖1可知，不同種類糖對醇溶蛋白糖基化過程中有害產物MGO/GO和AGEs量的變化趨勢較為一致。在體系中，MGO產生的量遠遠高于GO的量。不同糖產生MGO的量由大到小依次為果糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖；不同糖產生GO的量由大到小依次為阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖；AGEs產生量由大到小依次為：木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖。其中，單糖產生的美拉德反應產物明顯多于多糖，這是由于在質量相同時，大分子質量的糖含有的羰基數目較少，不容易與蛋白質發生反應，而且空間效應降低了反應活性，支鏈的空間位阻效應限制反應的進行[25]；并且反應程度與糖的分子質量有一定的正相關，開環比例高的短鏈糖具有高反應性[26]。阿拉伯糖和木糖產生的GO和AGEs的量多于其他幾種糖。蔗糖產生的3 種有害產物明顯低于多糖，可能因為多糖易于水解產生還原性單糖葡萄糖。在同等改性條件下，優先選擇多糖作為改性劑，以提高其安全性。而比較常用的3 種多糖改性劑，有害產物形成量依次為：淀粉＜葡聚糖＜麥芽糊精。

2.4 葡聚糖質量濃度對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

由圖1可知，多糖在蛋白質改性過程中產生的有害產物較少，而且多糖改性比單糖和雙糖更能提高蛋白的功能性[27]，由于葡聚糖是葡萄糖單元脫水聚合而成的一種高分子葡萄糖聚合物，無臭無味，易溶于水，具有高親水性，因此常用葡聚糖作為改性劑[28]。因此后續實驗均選用葡聚糖進行改性條件優化。

圖 2 葡聚糖質量濃度對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 2 Effect of dextran concentration on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

由圖2可知，隨著葡聚糖質量濃度的增加，MGO/GO和AGEs的生成量均呈上升趨勢，且3 個指標不同葡聚糖質量濃度之間存在顯著性差異（P＜0.05）；當葡聚糖質量濃度在1.0～2.0 mg/mL范圍，有害產物MGO/GO的增加幅度較大，尤其是MGO的生成的量遠高于GO，MGO增加了約50%；當質量濃度由2.0 mg/mL增加到8.0 mg/mL，有害產物的量緩慢增加。牛麗亞等[6]在小麥胚芽蛋白糖基化改性反應體系（底物質量分數2%、pH 11.0、90 ℃、30 min）中發現，隨著葡聚糖比例的增加，接枝度呈上升趨勢，但產物的溶解性呈先上升后下降趨勢，在改性比例1∶1（相當于葡聚糖質量濃度為2 mg/mL）時改性效果最佳。因此，在保證改性效果的前提下，應該盡量選擇低質量濃度的糖基化劑，如葡聚糖質量濃度控制在2 mg/mL以內以減少有害物質的產生。

2.5 反應溫度對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

圖 3 反應溫度對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

溫度越高，有害產物MGO/GO和AGEs的生成量均越多，各個產物在不同溫度產生量的差異性如圖3所示。從增長趨勢來看，80～100 ℃，體系中3 種有害產物大幅度增長，MGO和AGEs生成量分別增加了約85%和81%，

GO生成量增加了約50%。這是由于美拉德反應屬于吸熱反應，隨著溫度的升高，蛋白質鏈展開度增加，從而暴露出更多的游離氨基，其與糖的羰基反應進一步使反應加劇[29]，有害產物的量隨之增大。由此，結合改性效果考慮，控制改性在較低溫度下進行，可以降低體系中美拉德反應有害產物的形成。據報道，大麥蛋白、玉米谷蛋白均能在90 ℃達到良好的改性效果[29-30]。

2.6 反應時間對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響

圖 4 反應時間對醇溶蛋白改性過程中MGO/GO和AGEs含量的影響Fig. 4 Effect of reaction time on the amount of MGO/GO and AGEs in modified gliadin

由圖4可知，糖基化反應5 min，體系產生一定量有害產物MGO/GO和AGEs，其中MGO產生的量最高，約為GO的2 倍。5～20 min 3 種有害產物生成量快速增加，隨后20～120 min有害產物生成量呈現緩慢增加趨勢。除個別時間點外，3 種產物幾乎所有不同時刻均存在著顯著性差異（P＜0.05）。以葡聚糖對小麥胚芽蛋白改性30 min時（m（蛋白質）∶m（葡聚糖）＝1∶1、pH 11.0、溫度110 ℃），接枝度和溶解性最好[6]。張蓓等[25]以葡聚糖對燕麥蛋白糖基化改性（90 ℃，pH 9.0），隨著時間的延長，接枝度和溶解度先增加后趨于平緩，反應60 min時，蛋白質-糖的接枝度和溶解度達到最大。這是由于反應初期暴露在蛋白表面的游離氨基較快與糖反應，后期由于大量葡聚糖支鏈的引入，其空間位阻限制了反應的進行，導致美拉德反應進行緩慢，產物趨于平緩，接枝度和溶解性也趨于平緩。鑒于有害產物生成量隨著時間延長而增加的趨勢，改性時間不宜過長，長時間反應既能增加有害產物又能降低改性效果。然而，20 min內，有害產物尤其是MGO快速增加到接近峰值（138.21 μg/g），而僅僅靠縮短時間，安全性問題不可能得到解決，因此考慮添加天然抑制劑控制有害產物的形成。

2.7 抑制劑對改性條件下醇溶蛋白糖基化有害產物的抑制效應

圖5c表明除辣椒素外（辣椒素有熒光吸收，干擾熒光性AGEs的測定），其他9 種抑制劑均能有效抑制AGEs的活性，抑制率依次為槲皮素＞大黃素＞蘆丁＞Cys＞綠原酸＞染料木素＞兒茶素＞GSH＞阿魏酸，且抑制活性與添加濃度存在明顯量效關系（P＜0.05）。而阿魏酸對AGEs的抑制率較低，低于10%，且在0.05～1.00 mmol/L沒有顯著量效關系。結合圖5a、b可知，兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素4 種黃酮在濃度為0.10 mmol/L時對GO有一定的抑制效果，抑制率在14%～30%；而其他幾種天然抑制劑對GO沒有抑制活性；蘆丁、阿魏酸、染料木素、辣椒素和槲皮素對MGO有一定的抑制效果，抑制率在20%左右。本實驗中天然抑制劑對醇溶蛋白體系中MGO/GO的抑制率較低，且隨添加量的變化沒有一定的規律性，可能是由于醇溶蛋白改性是在強堿性（pH 11.0）、高溫（100 ℃）條件下進行的，天然抑制劑在高溫、堿性條件下不穩定，難以捕獲MGO/GO形成加合產物，從而影響MGO和GO抑制效果。Moon等[31]研究不同pH值（2.7、7.0、10.0）槲皮素溶液在不同溫度（室溫、4、-20 ℃）條件下的穩定性，結果表明在pH 10.0下反應120 min，槲皮素完全降解；有研究報道綠原酸在堿性條件下更容易被氧化，釋放兩個質子形成半醌結構[32-33]；大黃素結構中有3 個羥基，將其置于堿性溶液中會生成穩定的紅色絡合物[34]，破壞了大黃素原有的結構，因此在堿性改性條件下，以上天然產物不宜作為美拉德反應有害產物的抑制劑。

圖 5 抑制劑對改性條件下醇溶蛋白-葡聚糖體系糖基化有害產物的抑制效應Fig. 5 Impacts of inhibitors on the formation of MGO/GO and AGEs in the gliadin-dextran reaction system

當Cys質量濃度在0.50～1.00 mg/mL時，對GO的抑制率維持在27%，而對MGO的抑制率高達82%～97%，對AGEs抑制率為72%～83%。而低于0.50 mg/mL時，對GO和AGEs沒有抑制效果。推測其原因可能是當質量濃度較小時，Cys參與到美拉德反應中，隨著質量濃度增大，Cys的巰基、氨基均能與MGO/GO發生反應，從而減少體系中MGO和GO含量，同時抑制了AGEs的產生。與Cys相比，GSH對MGO的抑制率最高達到26%，遠遠低于Cys。Nomi等[35]報道了GSH可以通過谷氨酸殘基上的α-NH2基團與GO反應從而達到抑制GO的效果。而GSH對AGEs的抑制率高達62%～69%。推測可能為GSH的抗氧化作用抑制了AGEs生成。Zeng Jingmin等[36]研究表明GSH、Cys等有效抑制糖基化反應的機制為Cys殘基與1,2-二羰基化合物反應得到的硫醇醛加合物。因此，可以在醇溶蛋白改性過程中添加Cys或GSH作為有害產物的抑制劑。

2.8 抑制劑對改性醇溶蛋白乳化性能的影響

表 1 糖基化產物與抑制劑抑制產物的乳化活性Table 1 Emulsifying properties of glycosylated products as affected by added inhibitors

由表1可知，糖基化改性后醇溶蛋白的乳化活性得到顯著改善，提高了2.7 倍，改性效果良好；糖基化提高蛋白乳化性的主要原因是其溶解性的增加，同時糖鏈與蛋白質的共價交聯使得蛋白質的親水性增加，空間結構松散，蛋白質分子可以較快地吸附在油/水界面，表現出更高的乳化性[37]。添加抑制劑后兩種蛋白的乳化性依然顯著高于原蛋白，但明顯低于未添加抑制劑改性蛋白。添加了染料木素和Cys的蛋白，與單一改性組比，仍然保持了較高的乳化性能，且顯著降低MGO/GO和AGEs（圖5），與未改性的蛋白相比，乳化活性均有大幅度提高。推測抑制劑在抑制有害糖基化產物過程中對蛋白糖基化程度可能有一定影響，從而損失了一定的乳化性能，但在提高安全性的基礎上仍大大改善了蛋白乳化性能。

3 結 論

本研究建立了醇溶蛋白-糖體系，考察了糖種類、糖質量濃度、改性時間和溫度等因素對改性條件下美拉德反應有害產物MGO/GO和AGEs含量的影響；選擇兒茶素、蘆丁、染料木素、槲皮素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、GSH和Cys等篩分有效抑制劑，并考察了添加抑制劑對改性蛋白乳化性的影響。

8 種糖基化劑（木糖、阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麥芽糊精、葡聚糖、淀粉、蔗糖）在醇溶蛋白改性過程中均能與蛋白反應產生有害產物MGO/GO和AGEs。其中單糖產生的各種有害產物的量遠遠高于多糖，尤其是MGO含量遠高于GO。對比常用3 種多糖改性劑淀粉、葡聚糖、麥芽糊精，麥芽糊精產生的有害產物最多。

選擇葡聚糖作為改性劑，體系中MGO/GO和AGEs的生成量均隨著葡聚糖質量濃度（1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL）的增加、改性溫度（80、90、100、110 ℃）的升高以及改性時間的延長而增加，且趨勢均為先增加后趨于穩定。

選擇兒茶素、槲皮素、蘆丁、染料木素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素、Cys、GSH 10 種抑制劑。由于改性是在強堿（pH 11.0）、高溫（100 ℃）條件下進行的，導致兒茶素、槲皮素、蘆丁、染料木素、阿魏酸、綠原酸、大黃素、辣椒素的結構不穩定，抑制效果較差。而Cys和GSH則有一定的抑制作用，尤其是Cys，當Cys質量濃度在0.50～1.00 mg/mL時，對GO的抑制率維持在27%，而對MGO的抑制率高達82%～97%，對AGEs抑制率為72%～83%。

選擇效果較好的抑制劑蘆丁、染料木素、GSH和Cys，研究抑制劑對改性蛋白乳化性的影響，結果表明添加抑制劑后的改性蛋白組與常規改性組比，乳化活性有所下降，但仍然遠高于未改性的蛋白組。其中Cys、染料木素在降低有害產物的同時，仍然保持了較高的乳化性能。