不同凍結溫度下牛肉的肌原纖維蛋白變性與肌肉持水性

錢書意，李 俠，孫 圳，尚 柯，關文強*，張春暉,*

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；2.中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193）

自20世紀90年代以來，中國成為世界第一大肉類生產國[1]。現代肉與肉制品加工業中，畜禽冷凍肉是國家調節肉食品市場的重要產品。凍藏作為肉類重要貯藏方式，可有效延長產品貨架期，增加肉制品消費的機動性和可支配性[2]，是肉類產品進出口貿易和國內地區間的主要流動形態。然而，肉制品在冷凍貯藏期間蛋白質變性、持水性降低，導致凍藏肉在解凍后出現嚴重的汁液流失和品質劣變現象，造成嚴重的經濟損失[3]。肌原纖維蛋白作為肉類蛋白中的最主要成分，占總蛋白質含量的70%左右，肉類凍藏過程中的蛋白質變性主要是肌原纖維蛋白變性[4]。目前涉及凍結溫度對凍藏肉影響的研究主要集中在貯藏品質方面[5-6]，對于肌原纖維蛋白變性的影響鮮有研究；而對影響凍藏肉肌肉持水性因素的研究集中在凍結過程中的冰晶生長[7]、肌肉蛋白質組學[8]、脂肪氧化[9]等方面。有研究表明汁液流失和品質劣變可能在很大程度上是由于肌肉蛋白變性引起的[10]：李銀等[11]研究發現牛肉凍結解凍過程中蛋白質氧化導致其持水性降低；魏秀麗等[12]研究發現豬肉肌原纖維蛋白降解引起蛋白水合力下降進而形成汁液流失。然而，亦有研究認為蛋白變性與肌肉持水性變化之間并不存在直接聯系[9,13]。關于不同凍結溫度對牛肉肌原纖維蛋白變性的影響缺乏深入研究，肌肉蛋白質變性對汁液流失的作用機制尚不清楚。

目前我國凍藏肉工業生產中常用的凍結溫度-18、-23 ℃及-38 ℃，本實驗以牛背最長肌（bovine longissmus dorsi）作為研究對象，比較研究-9、-18、-23 ℃及-38 ℃ 4 組溫度條件下牛肉肌原纖維蛋白理化特性與肌肉持水性變化，旨在揭示不同凍結溫度下牛肉肌原纖維蛋白變性與肌肉持水性，并探討牛肉凍結過程中蛋白變性對肌肉持水性的影響，為研究新的抑制牛肉凍結過程中的蛋白變性方法，從而為控制凍藏肉解凍汁液流失提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉為北京御香苑畜牧有限公司提供的經檢疫合格、質量約為400 kg的2 歲草原魯西黃牛牛背最長肌。牛屠宰后在一定溫度（0～4 ℃）、相對濕度（90%）和循環冷風（風速2 m/s）的外部環境條件下吊掛風冷排酸48 h，從6 頭情況相近的公牛胴體中分別取2 塊背最長肌，共12 塊肉樣，每塊長、寬、高約為5 cm×4 cm×4 cm，運回實驗室后4 ℃冷藏并進行后續實驗。

ATPase測試盒 蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；735型溫度儀 德國德圖儀器有限公司；CR-400色差儀日本柯尼卡美能達公司；BCDW-228冰箱、DW-86L386型立式超低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；Q200差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀 美國TA公司；T6紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；MesoMR23-060H-I低場核磁共振（low field-nuclear magnetic resonance，LF-NMR）分析儀及成像系統 上海紐邁電子科技有限公司；鋼環式膨脹壓縮儀 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；C-LM型肌肉嫩度計 北京朋利馳科技有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 樣品凍結與解凍

將12 塊肉樣隨機分為4 組，放置于-9、-18、-23 ℃及-38 ℃條件下進行冷凍處理，將溫度儀傳感器插入肉樣幾何中心記錄中心溫度。為避免長時間冷凍對牛肉品質的影響，當樣品中心溫度均達到設定相應凍結溫度后平衡24 h，隨即取出樣品待測。解凍過程置于4 ℃冰箱，中心溫度達4 ℃后解凍完成。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 總巰基含量

參照李銀等[11]的方法，從牛背最長肌中分離提取肌原纖維蛋白。總巰基的測定使用Ellman試劑法[14]。將提取的蛋白溶液質量濃度調整為2 mg/mL，與1 mL含有6 mol/L鹽酸胍、1 mmol/L乙二胺四乙酸的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.3）以及含有10 μL 10 mmol/L 5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）的100 mmol/L Tris-HCl溶液（pH 7.6）混合，25 ℃環境下靜置25 min后于412 nm波長處測定其吸光度，巰基含量（nmol/mg）使用摩爾吸光系數13 600 L/（mol·cm）計算。

1.3.2.2 肌原纖維蛋白質溶解度

參考Joo等[14]的方法，準確稱取1.0 g肉樣，加入10 mL預冷的0.025 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）后冰浴勻漿。樣品處理后于4 ℃搖床上過夜抽提后離心（4 ℃、4 000×g、20 min），采用雙縮脲法測定上清液蛋白質量濃度，所得結果即為肌漿蛋白溶解度。稱取1.0 g肉樣，加入20 mL預冷的含1.1 mol/L碘化鉀的0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.2）后冰浴勻漿，樣品處理后于4 ℃搖床上過夜抽提后離心（4 ℃、4 000×g、20 min），采用雙縮脲法測定上清液蛋白質量濃度，所得結果即為肌肉全蛋白溶解度。肌原纖維蛋白溶解度為全蛋白溶解度與肌漿蛋白溶解度之差。

1.3.2.3 Ca2+-ATPase活力

采用ATPase測試盒（用于Ca2+、Mg2+-ATPase活力測定，微量法，100 管/48 樣）測定。通過測定酶解ATP產生的無機磷含量來確定ATP活力的高低。規定每小時每克組織中Ca2+-ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為一個酶活力單位。

1.3.2.4 肌肉熱穩定性分析

參考Deng等[15]的方法，取10～15 mg肉樣密封于鋁盒中進行DSC測定，以鋁盒為空白對照。測定條件如下：樣品于20 ℃平衡2 min，再以5 ℃/min的升溫速率升到100 ℃。每個樣品測定3 個平行，結果取3 次測定的平均值。用Universal Analysis 2000軟件分析各組樣品DSC圖譜各峰的變性溫度和變性焓。

1.3.2.5 持水性

用解凍汁液流失率和加壓失水率指標評價牛肉持水性能。

準確稱量解凍前后肉塊質量，按式（1）計算樣品的解凍汁液流失率。

加壓失水率參考Farouk等[16]的方法。順肉樣肌纖維方向切成約1 cm厚的薄片，準確稱量樣品質量。用雙層紗布包裹肉樣并在肉樣上下各墊18 層定性濾紙，使用鋼環式膨脹壓縮儀將肉樣加壓至35 kg并保持5 min，記錄加壓后肉樣質量。按式（2）計算樣品的加壓失水率。

1.3.2.6 水分分布及組成

參照謝小雷等[17]的方法。采用核磁共振分析軟件中的CPMG脈沖序列測定樣品中的橫向弛豫時間T2。將精確稱量的樣品置于核磁共振成像儀永磁場中心位置的射頻線圈中心，進行磁共振波譜測定。CPMG脈沖序列參數為：主頻23 MHz、偏移頻率286.781 3 kHz、90°脈沖時間17 μs；180°脈沖時間35 μs；采樣點數54 996；重復時間3 000 ms；累加次數4 次；回波數2 000。

1.3.2.7 質子密度成像

參照謝小雷等[17]的方法。使用MesoMR23-060H-I核磁共振分析及成像系統測定，將實驗樣品放入永磁場中心位置的射頻線圈中心，進行成像實驗。主要參數為：重復時間2 000 ms，重復次數4 次，縱向弛豫時間20 ms，根據CPMG序列測得的T2值，選擇自旋回波時間20 ms。

1.3.2.8 色差和剪切力

用色差儀直接測定樣品表面的L*值（亮度）、a*值（紅度）、b*值（黃度），每個樣品平行測定5 次，結果取5 次測量平均值。色差計在使用前用白板進行校準。

用直徑1.5 cm的取樣器平行于肉樣纖維方向取2.0 cm高的圓柱形，采用C-LM型肌肉嫩度計測定其剪切力，單位為N，每個處理的樣品平行測定5 次，結果取5 次測定平均值。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2007軟件處理數據并繪制圖表，結果以±s表示。利用IBM SPSS Statistics 19統計分析軟件的Duncan法多重比較進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，用Pearson相關系數法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同凍結溫度下的牛肉肌原纖維蛋白理化特性

2.1.1 巰基含量

肌原纖維蛋白主要成分是肌動蛋白和肌球蛋白，二者分子中含有大量巰基，凍結過程中巰基的氧化形成二硫鍵[18]，測定肌原纖維蛋白的巰基含量可反映出蛋白質的氧化變性程度。不同凍結溫度對肌原纖維蛋白巰基含量的影響見圖1。不同實驗組牛肉肌原纖維蛋白的巰基含量差異顯著，凍藏的溫度越低，巰基含量越高。-9、-18、-23 ℃及-38 ℃下凍結的試樣肌原纖維蛋白的巰基含量分別為75.30、78.73、81.56 nmol/mg和93.43 nmol/mg。其中-38 ℃下凍結試樣巰基含量顯著高于其他實驗組（P＜0.05），肌原纖維蛋白氧化程度最低。氧化效應是蛋白變性的重要表現，肌原纖維蛋白氧化使其構象發生改變，肌肉細胞受到損傷，導致肌肉持水性降低[11]，研究結果表明低溫凍結有利于抑制凍結過程中牛肉肌原纖維蛋白的氧化變性。

圖 1 不同凍結溫度下牛肉的肌原纖維蛋白巰基含量Fig. 1 Sulfrydryl contents of beef myofibrillar protein after freezing at different temperatures

2.1.2 蛋白質溶解度

蛋白質溶解度是評價肌肉蛋白質變性程度主要指標之一，溶解度越低說明蛋白聚集程度越高，常伴隨嚴重的變性現象。如圖2所示，-9、-18、-23 ℃及-38 ℃下凍結的試樣肌原纖維蛋白質溶解度分別為136.25、139.76、147.55 mg/g及153.13 mg/g。-23 ℃及-38 ℃實驗組蛋白質溶解度顯著高于-9 ℃與-18 ℃實驗組（P＜0.05）。冷凍使蛋白質的結構受到破壞，二硫鍵、氫鍵及疏水鍵形成，蛋白質之間的作用增強出現聚集現象，導致蛋白質溶解度降低[19]，蛋白質和水分子之間的作用力減弱，蛋白質疏水性增強，肌肉持水性受到影響。實驗結果表明，凍結溫度越低，越有利于維持牛肉肌原纖維蛋白質溶解度，減輕蛋白質聚集程度。

圖 2 不同凍結溫度下牛肉蛋白質溶解度Fig. 2 Protein solubility of beef after freezing at different temperatures

2.1.3 Ca2+-ATPase活力

Ca2+-ATPase活力是衡量肌球蛋白分子完整性的有效指標[20]，凍藏過程中肌原纖維蛋白變性會引起Ca2+-ATPase活力下降。不同凍結溫度下牛肉的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力見圖3，凍結溫度越低，試樣肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力越高。-9、-18、-23 ℃及-38 ℃下凍結的試樣肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力分別為32.68、33.88、35.76 μmol/（g·h）和36.38 μmol/（g·h），-38 ℃下凍結試樣Ca2+-ATPase活力顯著高于-9 ℃實驗組（P＜0.05）。結果表明凍結溫度越低，越有利于維持牛肉肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase活力。肌原纖維蛋白的主要成分是肌球蛋白，牛肉凍結過程中肌球蛋白頭部構象改變及蛋白質聚集現象導致Ca2+-ATPase活力下降[21]。此外，Ca2+-ATPase活力降低也可能與肌球蛋白頭部巰基的氧化相關[20]。本研究中，凍結溫度越低的試樣Ca2+-ATPase活力越高，這與此前所得的蛋白質溶解度及巰基含量結果相符。

圖 3 不同凍結溫度下牛肉的肌原纖維蛋白-ATPase活力Fig. 3 Ca2+-ATPase activity of beef myofibrillar protein after freezing at different temperatures

2.1.4 蛋白熱穩定性

圖 4 DSC熱流圖Fig. 4 DSC heat flow diagram

圖 5 不同凍結溫度下牛肉蛋白總變性焓Fig. 5 Total denaturation enthalpy of beef myofibrillar proteins after freezing at different temperatures

表 1 牛肉蛋白質DSC分析結果Table 1 DSC analysis of beef myofibrillar proteins

由圖4可見，DSC圖譜中有3 個峰，峰I、峰II、峰III分別代表肌球蛋白頭部、肌球蛋白尾部和肌漿蛋白、肌動蛋白變性引起的熱流變化[22]。峰頂點對應的溫度為蛋白變性溫度，峰面積則代表蛋白質變性焓。蛋白質變性溫度與變性焓可反映蛋白質的熱穩定性，變性溫度與變性焓越高，蛋白質的熱穩定性越高、變性程度越小[23]。總變性焓可以反映出樣品整個蛋白的變性程度，值為峰I、峰II、峰III的變性焓值之和[24]。結果表明，不同溫度下凍結的牛肉蛋白熱變性溫度總體無顯著差異；隨著凍結溫度降低，肌球蛋白頭部、肌球蛋白尾部和肌漿蛋白以及肌動蛋白的變性焓總體呈上升趨勢（表1）。圖5為不同溫度下凍結牛肉蛋白質總變性焓，-23 ℃和-38 ℃試樣的總變性焓值分別為0.98 J/g和1.01 J/g，顯著高于-9 ℃和-18 ℃的0.50 J/g和0.73 J/g（P＜0.05），說明-23 ℃和-38 ℃試樣蛋白質熱穩定性較高，變性程度低。DSC結果分析可以看出，凍結溫度越低，牛肉肌原纖維蛋白的熱穩定性越高。任麗娜[25]研究白鰱魚肌原纖維蛋白冷凍變性時發現凍藏溫度越低魚肉蛋白質熱穩定性越高，與本實驗結果一致。

2.2 不同凍結溫度下牛肉持水性

表 2 不同凍結溫度下牛肉的解凍汁液流失率及加壓失水率Table 2 Thawing loss and pressing loss of beef after freezing at different temperatures

解凍汁液流失率和加壓失水率為衡量肌肉持水性的重要指標，與肌肉持水性呈負相關[26]。由實驗結果可知（表2），牛肉的解凍汁液流失率隨著凍結的溫度降低而減小。-38 ℃下凍結試樣的解凍汁液流失率為3.11%，顯著低于-9 ℃的7.27%（P＜0.05）。加壓失水率與解凍汁液流失實驗結果相符，-38 ℃下凍結試樣的加壓失水率為30.12%，顯著低于-9 ℃的33.05%（P＜0.05）。結果表明，解凍牛肉的持水性隨凍結溫度降低而升高，李俠等[27]也得到相似實驗結果。本研究旨在驗證肌原纖維蛋白變性對肌肉持水性的影響，然而，牛肉在凍結過程中冰晶大量生長，肌肉組織受到嚴重破壞，也是導致解凍時水分易從肌肉中釋放造成汁液流失的重要原因。溫度越低，凍結速率越快，生長的冰晶體積越小且分布越均勻[28]，肌肉受破壞程度小，肌肉持水性越高。

2.3 不同凍結溫度下牛肉不同狀態水分布

利用LF-NMR可定量分析肌肉中3 種狀態水（結合水、不易流動水及自由水）的分布和組成[29]。

由表3可知，隨著凍結溫度降低，牛肉中自由水和不易流動水相對比例顯著降低（P＜0.05），結合水相對比例顯著升高（P＜0.05）。自由水是指胞外能自由流動的水，是汁液流失的來源[30]。比較解凍后樣品不同狀態水分的相對含量可知，-23 ℃和-38 ℃實驗組肉樣解凍后自由水相對比例顯著低于-9 ℃與-18 ℃（P＜0.05）。自由水是汁液流失的來源，LF-NMR結果表明，低溫凍結肉樣解凍后自由水比例顯著降低（P＜0.05），這也驗證了此前持水性實驗結果。凍結過程中的蛋白變性導致蛋白結構的改變會使肌肉水分的分布與遷移發生變化[31]，進而影響肌肉持水性。

表 3 不同溫度凍結后牛肉水分分布及組成Table 3 Moisture distribution and composition of beef after freezing at different temperatures

2.4 不同凍結溫度下牛肉H質子密度

圖 6 牛肉凍結、解凍后的H質子密度加權偽彩圖Fig. 6 Proton density weighted pseudocolor images of beef after freezing-thawing at different temperatures

MRI可將物料內部H質子的分布以圖像的形式表達出來，圖像中亮度越強，表明H質子密度越高，即該部分的含水率越高[17]。由圖6可見，隨著凍結溫度的降低，H質子密度圖像中褐色逐漸消失，-23 ℃和-38 ℃下凍結的肉樣僅存零星的“亮點”。解凍后各組肉樣出現彩色的H

質子密度圖像，且凍結溫度越低，肉塊較多地呈現亮褐色。-9 ℃和-18 ℃溫度下凍結后解凍肉樣較多地呈現藍色，說明該兩組肉樣解凍后汁液流失嚴重，與2.2節解凍汁液流失率的實驗結果一致。

2.5 不同溫度凍結后解凍牛肉色澤和嫩度

表 4 不同凍結溫度下牛肉的色澤和剪切力Table 4 Color and shear force of beef after freezing at different temperatures

肉的色澤與持水性有一定相關性[32]。肉色的L*值、a*值及b*值分別代表肉樣的亮度、紅度和黃度[33]。實驗結果表明（表4），凍結溫度越低，牛肉解凍后表面L*值越小：-38 ℃下凍結肉樣L*值為38.62，顯著低于-9、-18 ℃和-23 ℃的45.34、44.42和42.85（P＜0.05）。分析原因可能由于低溫凍結試樣解凍汁液流失少，肉樣表面不至于附著過多水分，導致光線折射率低、亮度下降；a*值越大說明肉色越鮮艷，肉樣越新鮮。-23 ℃和-38 ℃試樣的a*值分別為23.82和24.01，顯著高于-9℃和-18℃的21.31和20.60。肉樣紅度主要決定于所含氧合肌紅蛋白數目，低溫凍結可抑制氧合肌紅蛋白進一步氧化為高鐵肌紅蛋白[34]；b*值越高說明肉色越黃，肉樣越不新鮮。-23 ℃和-38 ℃試樣的b*值分別為13.35和9.57，顯著低于-9 ℃和-18 ℃的16.88和14.30。b*值升高是由于脂肪氧化和蛋白質的變性[35]，此前研究結果表明，凍結溫度越低對蛋白變性抑制效果越明顯，解釋了b*值的實驗結果。

細胞間隙中的水分對肌肉嫩度有重要影響，肌肉的持水能力越高，嫩度越好[36]。剪切力能夠反映肉樣嫩度，剪切力越小對應嫩度越高。實驗結果表明（表4），不同溫度下凍結的牛肉剪切力差異顯著（P＜0.05），凍結溫度越低，解凍后牛肉的剪切力越小，嫩度越好。-9 ℃下凍結牛肉解凍后剪切力為82.43 N，顯著高于-18、-23 ℃及-38 ℃的67.14、61.21 N及56.20 N。牛肉解凍時出現水分流失導致肌肉收縮，剪切力因此增加，牛肉嫩度降低[23]。低溫凍結更有利于減少牛肉汁液流失，進而維持解凍后牛肉的嫩度。

2.6 相關性分析

表 5 肌原纖維蛋白理化特性與肌肉持水性相關性分析Table 5 Pearson correlation coefficients between myofibrillar protein denaturation and water-holding capacity

對-9、-18、-23 ℃及-38 ℃下凍結牛肉的色澤、嫩度、解凍汁液流失率和加壓失水率以及肌原纖維蛋白理化特性進行相關性分析，結果如表5所示。蛋白質溶解度與解凍汁液流失率（r＝-0.876，P＜0.01）和加壓失水率（r＝-0.918，P＜0.01）呈極顯著負相關，亦與L*值、b*值及剪切力均呈極顯著負相關（P＜0.01）；Ca2+-ATPase活力與解凍汁液流失率（r＝-0.820，P＜0.01）、加壓失水率（r＝-0.863，P＜0.01）呈極顯著負相關，與L*值、b*值及剪切力均呈顯著負相關（P＜0.01，P＜0.05）；巰基含量與解凍汁液流失率（r＝-0.861，P＜0.01）、加壓失水率（r＝-0.792，P＜0.01）呈極顯著負相關，與L*值、b*值及剪切力均呈極顯著負相關（P＜0.01）；蛋白質總變性焓與解凍汁液流失率（r＝-0.765，P＜0.01）、加壓失水率（r＝-0.822，P＜0.01）呈極顯著負相關，亦與L*值、b*值及剪切力呈極顯著負相關（P＜0.01）。L*值及b*值均與解凍汁液流失率和加壓失水率呈極顯著正相關（P＜0.01）。剪切力與解凍汁液流失率、加壓失水率呈極顯著正相關（P＜0.01）。肌原纖維蛋白理化特性（蛋白質溶解度、Ca2+-ATPase活力、巰基含量、總變性焓）與肌肉持水性（解凍汁液流失率、加壓失水率）均呈極顯著相關（P＜0.01）。結果表明，牛肉在凍結過程中，肌原纖維蛋白出現變性，引起蛋白質溶解度、Ca2+-ATPase活力、巰基含量及總變性焓的變化，對肌肉持水性產生顯著影響，進而導致不同溫度凍結的牛肉解凍后色澤和嫩度出現差異。

3 結 論

牛肉在-9、-18、-23 ℃及-38 ℃下凍結，溫度越低，肌原纖維蛋白變性程度越小（肌原纖維蛋白質溶解度、Ca2+-ATPase活力、巰基含量及總變性焓均顯著升高）。

解凍汁液流失率隨著凍結的溫度降低而減小（P＜0.05），-38 ℃下凍結試樣的解凍汁液流失率為3.11%，顯著低于-9 ℃實驗組的7.27%（P＜0.05），解凍后肉樣的加壓失水率也存在相同規律。凍結溫度越低，越有利于維持牛肉持水性，解凍后肉色維持越好、嫩度越高。

肌原纖維蛋白理化特性（溶解度、Ca2+-ATPase活力、巰基含量、總變性焓）與肌肉持水性（解凍汁液流失、加壓失水率）均呈極顯著相關（P＜0.01），L*、b*值及剪切力肌肉持水性亦存在極顯著相關（P＜0.01），表明牛肉凍結過程中肌原纖維蛋白變性對肌肉持水性存在顯著影響，并表現于牛肉解凍后的色澤、嫩度和汁液流失方面。