向日葵莖髓醇提物中不同溶劑萃取部位總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性

張 鶴，張 瑩，楊逢建，祖元剛，陳小強*

（東北林業大學 森林植物生態學教育部重點實驗室，生物資源生態利用國家地方聯合工程實驗室（黑龍江），黑龍江 哈爾濱 150040）

自由基是機體在生化反應中產生的性質活潑且具有極強氧化功能、可以導致細胞損傷和機體衰老的物質[1]。當機體細胞處于氧化脅迫狀態時，攝入外源性抗氧化劑有可能逆轉這種脅迫，保護細胞免受自由基的侵害，進而阻止或延緩許多慢性疾病的發生和發展[2-4]。研究表明，許多植物提取物和植物化學成分對維持體內的自由基平衡具有重要作用，或可直接清除自由基，或可直接對抗自由基脅迫造成的組織或細胞損傷，還可增強機體本身的抗氧化酶系統，從多個環節抑制體內自由基過多帶來的生理性損傷作用[1]，許多植物源提取物[5]和酚類[6]、黃酮類[7]、醌類[8]、皂苷[9]、多糖[10]、生物堿[11]等化學成分均已被證實具有很好的抗氧化活性。

向日葵（Helianthus annuus L.）為菊科向日葵屬植物，一年生高大草本，原產于北美洲，世界各國均有栽培[12]。向日葵是僅次于棕櫚、大豆和油菜的主要油料作物[13]，同時有很高的藥用價值，其葉、花、花盤、果殼、根、莖內髓心（向日葵莖髓）均可入藥，其中向日葵莖髓具有清熱、利尿、止咳的功效，主治淋濁、白帶、乳糜尿、百日咳、風疹[14]。研究表明，向日葵的化學成分主要為倍半萜、二萜、倍半萜內酯、三萜類等萜類化合物[15]，還含有甾醇、香豆素[15]、酚類[16-17]、黃酮類[18-19]和揮發性化合物[20]。秸稈是向日葵產業的主要副產物之一，多被當作燒柴甚至被廢棄[21]，其本身所具有的食藥用價值和經濟價值尚未引起足夠的重視，其酚類、黃酮類抗氧化成分含量及活性的相關研究也鮮有開展。為此，本實驗中選取向日葵莖髓為實驗材料，測定其乙醇提取物的不同極性萃取部位的總酚和總黃酮含量及抗氧化活性的異同，并進行其相關性分析，可為向日葵莖髓的進一步開發利用提供數據參考，對于提高向日葵資源利用率和綜合經濟效益以及環境保護均具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

向日葵莖植物材料于2015年秋季采集于黑龍江省哈爾濱市，由東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室鑒定為菊科植物向日葵（H. annuus L.）的干燥莖。

沒食子酸標準品 上海融禾醫藥科技有限公司；蘆丁標準品、福林-酚試劑 上海源葉生物科技有限公司；2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（tripyridyltriazine，TPTZ） 美國Fluka公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、過硫酸鉀、乙酸鈉 美國Sigma-Aldrich公司；水溶性VE（Trolox） 加拿大TRC公司；所有提取溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

超聲波清洗機 深圳市潔盟清洗設備有限公司；RE-2000B旋轉蒸發器 上海一科儀器有限公司；752N型紫外-可見分光光度計 上海精科實業有限公司；JJ124BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 不同極性萃取部位的制備

剝取向日葵莖髓，風干并粉碎，過40 目篩，精密稱取莖髓粉末100 g于錐形瓶中，按料液比1∶30（m/V）加入體積分數為70%的乙醇，在功率為100 W、溫度為40 ℃的條件下超聲提取3 次，每次30 min，合并3 次提取液，過濾，減壓回收溶劑至提取物無醇味。將乙醇提取物用適量去離子水充分混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取，減壓回收溶劑，得到向日葵莖髓石油醚萃取部位（PE）、乙酸乙酯萃取部位（EE）和正丁醇萃取部位（BE），－20 ℃保存備用。

1.3.2 總酚含量的測定

各萃取部位總酚含量通過福林-酚法進行測定[22]，稍作改動。依次向試管中加入0.2 mL萃取部位溶液、0.8 mL蒸餾水、0.2 mL福林-酚試劑，混勻并室溫靜置5 min，依次加入2 mL 0.07 g/mL碳酸鈉溶液、1.6 mL蒸餾水，混勻后常溫避光反應90 min，于波長765 nm處測定吸光度。各樣品的總酚含量參考標準曲線用每克干樣品中酚類化合物相當于沒食子酸的質量表示（mg/g）。所有樣品均測定3 次。

1.3.3 總黃酮含量的測定

各萃取部位總黃酮含量依據文獻[23]方法測定，稍作改動。將萃取部位配制成100 mg/mL的待測溶液備用。取2.4 mL待測樣品溶液與0.3 mL 0.05 g/mL亞硝酸鈉溶液混勻靜置；6 min后加入0.3 mL 0.10 g/mL硝酸鋁溶液，混勻靜置；5 min后加入4 mL 0.04 g/mL氫氧化鈉溶液，待反應液充分混勻15 min后，于波長510 nm處測定吸光度。根據蘆丁標準曲線計算總黃酮含量。總黃酮含量以每克干樣品中黃酮類化合物相當于蘆丁的質量表示（mg/g）。所有樣品均測定3 次。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考文獻[24]，稍作改動。用甲醇將DPPH配制成60 μmol/L的溶液，將向日葵莖髓萃取部位配制成50.00、25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78 mg/mL的樣品液，量取0.1 mL樣品溶液與0.9 mL DPPH溶液充分混勻，避光靜置30 min后，以甲醇作為空白對照，于波長517 nm處測定吸光度，每個樣品平行測定3 次。DPPH自由基清除率按公式（1）計算，VC作為陽性對照。再根據系列質量濃度下的清除率計算出半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A空白為0.9 mL DPPH溶液與0.1 mL甲醇溶液混合后的吸光度；A樣品為0.9 mL DPPH溶液與0.1 mL樣品溶液混合后的吸光度。

1.3.5 ABTS+·清除能力的測定

ABTS+·清除能力測定參考文獻[5]，稍作改動。將7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液按0.5∶1.0（V/V）混勻，室溫避光靜置12～16 h，得到ABTS儲備液。將此儲備液與蒸餾水按照1∶20（V/V）混合，在734 nm波長處調節吸光度為0.80±0.02，得到ABTS工作液。取0.1 mL萃取部位樣品溶液分別與3.9 mL的ABTS工作液混勻，避光反應10 min后于波長734 nm處測定吸光度。每個樣品平行測定3 次。按公式（2）計算樣品對ABTS+·的清除率。

式中：A空白為0.1 mL對應溶劑與3.9 mL ABTS工作液混合后的吸光度；A樣品為0.1 mL樣品與3.9 mL ABTS工作液反應后的吸光度。

用不同濃度Trolox溶液重復以上操作，以ABTS+·清除率/%為縱坐標，以Trolox溶液濃度/（μmol/L）為橫坐標，繪制標準曲線。樣品ABTS+·清除能力用每克干樣品的Trolox當量表示（μmol/g）。

1.3.6 FRAP測定

鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）的測定參考文獻[25]，稍作改動。將0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、l0 mmol/L TPTZ溶液（溶于40 mmol/L鹽酸）、20 mmol/L氯化鐵溶液按10∶1∶1（V/V）混勻，得到FRAP工作液。取0.1 mL萃取部位樣品溶液加入到2.45 mL FRAP工作液中，充分混合，暗反應60 min，于波長593 nm處測定其吸光度。用不同濃度Trolox溶液重復以上操作，繪制標準曲線（以Trolox溶液濃度/（μmol/L）為橫坐標，吸光度為縱坐標）。樣品FRAP用每克樣品的Trolox當量表示（μmol/g）。

1. 4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 各萃取部位中的總酚、總黃酮含量分析

表 1 向日葵莖髓各萃取部位總酚、總黃酮的含量Table 1 Contents of total phenols and total flavonoids in different solvent extracts of sunflower stalk pith

由表1可知，總酚和總黃酮在不同極性萃取部位中的含量差異明顯：其中以EE中的總酚、總黃酮含量最高，分別為（1.60±0.10）mg/g和（20.50±1.55）mg/g；其次是PE，分別為（1.00±0.03）mg/g和（5.37±1.54）mg/g。3 種萃取部位的總酚、總黃酮含量的單因素方差分析和多重比較（Duncan法）結果顯示：PE與EE、EE與BE及PE與BE總酚含量之間均有顯著性差異（P＜0.05），總酚含量大小依次為EE＞PE＞BE；EE與PE、EE與BE總黃酮含量之間均有顯著性差異（P＜0.05），總黃酮含量大小依次為EE＞PE＞BE。因此，乙酸乙酯從向日葵莖髓乙醇提取物中富集的酚類和黃酮類成分含量最高，可見其對乙醇提取物中酚類和黃酮類成分的初步分離是有效的。

2.2 DPPH自由基清除能力分析

圖 1 向日葵莖髓各萃取部位對DPPH自由基清除能力的影響Fig. 1 Scavenging effects of different solvent extracts from sunflower stalk pith on DPPH radicals

由圖1可見，當樣品質量濃度在0.78～25.00 mg/mL之間時，不同萃取部位清除DPPH自由基的能力隨著樣品質量濃度的增大而增強。在樣品質量濃度為3.13 mg/mL時，EE對DPPH自由基的清除率為53.76%，高于PE（23.81%）和BE（21.26%）。

3 種萃取部位對DPPH自由基的清除能力由大到小順序為EE＞PE＞BE。PE和BE對DPPH自由基清除率的IC50分別為（13.92±0.85）mg/mL和（36.64±1.23）mg/mL，均高于EE（（2.56±0.10）mg/mL），且差異顯著（P＜0.05），表明不同極性溶劑得到的萃取部位有效成分含量之間存在一定差異，中等極性的EE對DPPH自由基清除率最高，而小極性的PE和較大極性的BE對DPPH自由基的清除率較低。但3 種萃取部位中對DPPH自由基清除能力最好的EE其IC50仍顯著高于VC（未在圖中顯示，（0.05±0.00）mg/mL，P＜0.05）。

2.3 ABTS+·清除能力分析

以T r olo x繪制標準曲線，得到回歸方程Y＝0.523 39X-0.005 36，R2＝0.999 5。根據萃取部位樣品的ABTS+·清除率和標準曲線計算出各萃取部位樣品ABTS+·清除能力。

圖 2 向日葵莖髓各萃取部位對ABTS＋·清除能力的影響Fig. 2 Scavenging effects of different solvent extracts from sun flower stalk pith on ABTS+·

由圖2可知，向日葵莖髓EE的ABTS+·清除能力最強，為（52.00±1.97）μmol/g；其次為PE（（22.63±0.40）μmol/g）；BE活性最低，為（11.53±0.25）μmol/g。不同萃取部位ABTS+·清除率的單因素方差分析和多重比較（Duncan法）結果顯示，EE對ABTS+·清除能力與其他兩種萃取部位之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.4 FRAP分析

以Trolox繪制標準曲線，得到回歸方程Y＝0.745 54X+0.099 17，R2＝0.999 3。

圖 3 向日葵莖髓各萃取部位對FRAP的影響Fig. 3 FRAP activity of different solvent extracts from sunflower stalk pith

由圖3可見，向日葵莖髓EE的FRAP最強，為（120.57±0.74）μmol/g，其次為PE（50.11±1.16）μmol/g和BE（48.00±4.17）μmol/g。不同萃取部位FRAP的單因素方差分析和多重比較（Duncan法）結果顯示，EE的FRAP與其他兩種萃取部位存在顯著性差異（P＜0.05）。這一檢測結果與2.2、2.3節兩種抗氧化活性檢測結果是一致的，說明向日葵莖髓中的抗氧化成分主要集中在中等極性的EE中。

2.5 總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性分析

表 2 向日葵莖髓各萃取部位總酚、總黃酮含量與抗氧化活性的相關性Table 2 Correlation between antioxidant activities and total phenols and flavonoids contents of extracts from sunflower stalk pith

由表2可知，向日葵莖髓各萃取部位總酚、總黃酮含量與其DPPH自由基、ABTS+·清除能力及FRAP均呈極顯著正相關，表明萃取部位中總酚、總黃酮含量越高，其對DPPH自由基和ABTS+·清除能力以及FRAP越強，該萃取部位的抗氧化活性越強。由相關系數可知，各萃取部位中總酚含量對DPPH自由基和ABTS+·清除能力的影響大于總黃酮，而總黃酮含量對FRAP的影響大于總酚。結果提示向日葵莖髓各萃取部位中的總酚和總黃酮可能是其具有抗氧化活性的物質基礎。

3 討 論

從植物中尋找抗氧化活性成分一直是天然產物化學的研究熱點之一。研究表明，天然抗氧化劑主要來源于植物酚類及黃酮類化合物[26]。向日葵中研究較多的具有抗氧化活性的酚類成分主要為綠原酸[16-17,27-28]，其研究材料多為向日葵種子或籽粕，而關于向日葵莖及莖髓中綠原酸含量的報道較少，文獻[29]顯示成熟期莖髓中綠原酸含量高于0.5 mg/g，但本課題組之前的研究中通過薄層色譜檢測未發現該成分，推測原因為檢測方法的靈敏度不夠或實驗材料中綠原酸含量過低。關于向日葵中黃酮類成分的報道中，楊樹平等[30]優化了秋季采摘向日葵盤總黃酮的提取工藝并測定其含量，在優化的工藝條件下（乙醇體積分數50%、提取溫度80 ℃、反應時間2 h），向日葵盤中總黃酮得率為33.64 mg/g。高銀祥等[29]對不同生長階段的向日葵植株中黃酮和多酚含量進行了測定，其結果顯示黃酮和多酚在向日葵植株中的分布以花、葉和花盤為主，成熟期葉和花盤中黃酮含量分別為8.34 mg/g和9.41 mg/g，而不同生長階段莖髓中黃酮和多酚含量均較低（低于2 mg/g）。Javed[31]對生長期為40 d的向日葵根、莖、葉中的總酚和總黃酮含量進行了測定，莖中的總酚和總黃酮含量分別為200.0～256.7 mg/g和45.0～65.7 mg/g。本研究結果與上述文獻結論表明，酚類和黃酮類成分在向日葵莖髓中均有一定積累，這也可能是莖髓醇提物不同萃取部位具有抗氧化活性的原因。本研究測得莖髓總酚含量約為高銀祥等[29]研究結果的1.5 倍，但均遠低于Javed[31]以苗期向日葵植株為材料所測得的結果；總黃酮含量約為高銀祥等[29]檢測結果的15 倍，約為Javed[31]研究結果的1/2。不同研究中總酚和總黃酮檢測結果存在一定差異，一方面可能是由于實驗材料的原植物生長環境、采集時間等條件不同而導致相關成分的積累有所差異；另一方面由于酚類和黃酮類成分種類較多，不同極性溶劑和處理方法對不同成分的溶解性不同，也可能會使得到的提取物/萃取部位在成分和含量方面存在差異。

植物源酚類和黃酮類成分含量及種類與其抗氧化活性密切相關。本研究結果顯示，不同極性溶劑萃取得到的向日葵莖髓萃取部位中酚類和黃酮類含量均存在顯著差異。綜合DPPH自由基和ABTS+·清除能力以及FRAP的實驗結果可以發現，3 種萃取部位的抗氧化活性強弱依次為EE＞PE＞BE。不同極性向日葵莖髓萃取部位總酚和總黃酮含量與抗氧化活性呈正相關，這與相關研究報道是一致的[32]。由此推斷，中等極性的乙酸乙酯更有利于向日葵莖髓中酚類和黃酮類成分的萃取，從而影響萃取部位的抗氧化活性。目前，國內外對植物源抗氧化活性成分的篩選實驗較多，而對于抗氧化活性成分的構效關系、作用機制、抗氧化活性成分間的協同或拮抗作用等方面仍缺乏系統性研究，尚未形成規律性的科學依據和結論[33]。因此，向日葵莖髓中酚類和黃酮類成分的種類、結構、抗氧化活性及相互作用等還需要進一步探討。

4 結 論

向日葵莖髓乙醇提取物PE、EE和BE均含有一定量的酚類和黃酮類成分，且這兩類成分都以EE中的含量最高，分別為（1.60±0.10）mg/g和（20.50±1.55）mg/g，與其他兩種極性萃取部位相比具有顯著差異（P＜0.05）。對3 種萃取部位的DPPH自由基、ABTS+·清除能力和FRAP檢測發現，其抗氧化能力與總酚和總黃酮含量呈正相關，即EE在3 種檢測方法中均具有最優的抗氧化活性。相關性分析結果表明，3 種萃取部位的抗氧化能力與其含有的總酚和總黃酮含量呈極顯著正相關（P＜0.01），提示酚類和黃酮類成分可能是向日葵莖髓具有抗氧化活性的物質基礎。