提取方法對黃秋葵花多糖的結構組成及抗氧化活性的影響

蘇 平，孫 昕，宋思圓*，魏 丹

（浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus（L.）Moench）是原產于非洲的錦葵科熱帶植物，其花中富含多糖、蛋白質、黃酮、脂肪酸、礦物質元素等物質，營養保健價值高，具有很大的開發潛力[1-2]。黃劍波等[3]以成熟的黃秋葵為原料，研究了硫酸鋁沉淀法提取果膠的工藝方法，黃秋葵的果膠提取率達到25.96%，證明黃秋葵是一種果膠含量高的植物資源，因此可將其作為一種優質的多糖資源。

多糖的提取有熱水提取法、酸提法、酶提法、超聲提取法等[4-5]。黃秋葵葉水提多糖存在α-糖苷鍵構型，原子力顯微鏡觀察結果表明多糖分子間相互纏繞，呈規則團聚狀，經進一步的抗氧化性實驗研究可知，黃秋葵葉粗多糖對自由基有一定的清除作用[6]。劉曉霞[7]采用酸法提取黃秋葵花中的果膠類多糖，并研究了其理化性質、流變特性和結構等，發現黃秋葵花果膠類多糖是一種主要由半乳糖、鼠李糖以及半乳糖醛酸組成的酸性雜多糖。宋思圓等[8]研究超聲輔助提取黃秋葵花果膠多糖的抗氧化活性，結果表明經超聲輔助提取得到的黃秋葵花果膠多糖有較好的體外抗氧化活性，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力為（91.31±1.05）mg Trolox/g，2’-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基清除能力為（50.05±2.50）mg Trolox/g，鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）為（65.96±0.14）mg Trolox/g以及氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）為（25.74±1.29）mg Trolox/g。有研究表明提取方法會顯著影響多糖的提取率、結構特征以及生物活性[1]。但目前不同提取方法與黃秋葵花多糖的結構及生物活性之間的關系鮮有報道[9]。因此，本實驗比較了熱水、酸法、酶法、超聲輔助提取法對黃秋葵花多糖提取效果的影響，并對所提多糖的結構組成和抗氧化能力進行了研究，以期為黃秋葵多糖的綜合開發利用提供技術和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵花產自浙江嘉善，品種為纖指黃秋葵花，60 ℃烘干，粉碎后過60 目篩備用；氯化鈉、三氟乙酸、鹽酸、檸檬酸、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazalone，PMP）、纖維素酶（15 000 U/g）、甲醇、VC、過硫酸鉀、95%乙醇均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司；DPPH、水溶性維生素E（Trolox）均為分析純、2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；2,2’-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH）、ABTS、熒光素鈉均為分析純 上海阿拉丁試劑有限公司；DEAE-Q Sepharose Fast Flow纖維素填料 英國Watman公司。

1.2 儀器與設備

DC-0506低溫恒溫槽 寧波海曙賽福實驗儀器廠；SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；PH070A恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；TGL20M高速冷凍離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；JA1003N電子天平 上海菁海儀器有限公司；Multiskan GO全波長酶標儀 美國Thermo公司；DAWN HELEOS Ⅱ多角度激光散射檢測器 美國Wyatt公司；1836-A烏氏黏度計 浙江臺州椒江玻璃儀器廠；Avatar370傅里葉變換紅外光譜儀 美國Nicolet公司。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵花多糖的提取及提取率的測定

1.3.1.1 黃秋葵花多糖的超聲提取工藝

按照Wang Wenjun等[10]所報道的工藝條件提取，提取溫度為60 ℃，按1∶40（m/V）的料液比加入蒸餾水，在95 W的功率下提取30 min，將提取液離心并收集上清液，加入3 倍體積95%乙醇溶液，4 ℃下沉淀過夜，離心；沉淀物依次用體積分數70%乙醇溶液、體積分數95%乙醇溶液、無水乙醇洗滌，復溶，透析48 h，凍干得到樣品（CUOFP）備用。

1.3.1.2 黃秋葵花多糖的酶法提取工藝

根據李文德等[11]報道的方法并略作修改，準確稱取黃秋葵花粉20 g，使用纖維素酶，加酶量為1%（以黃秋葵花粉質量計），料液比為1∶40（m/V），用pH 4.8的檸檬酸緩沖液作為溶劑，在50 ℃下水浴提取3 h，按1.3.1.1節方法收集上清液，醇沉，離心，復溶，透析，凍干得到樣品（CEOFP）備用。

1.3.1.3 黃秋葵花多糖的酸法提取工藝

采用劉曉霞[7]優化的方法，準確稱取黃秋葵花粉20 g，料液比1∶30（m/V），加入pH 1.6的鹽酸溶液，水浴溫度為90 ℃，提取2.5 h，按1.3.1.1節方法收集上清液，經醇沉、離心、復溶、透析、凍干得到樣品（CAOFP）備用。

1.3.1.4 黃秋葵花多糖的熱水浸提工藝

按Zhu Zhenyuan等[12]報道的方法制備并進行一定的修改，準確稱取黃秋葵花粉20 g，按料液比1∶30（m/V）加入蒸餾水，在80 ℃下水浴提取2 h，按1.3.1.1節方法收集上清液，醇沉，離心，復溶，透析，凍干得到樣品（CHOFP）備用。

1.3.1.5 黃秋葵花多糖提取率的計算

黃秋葵花多糖提取率的計算參照文獻[7]，計算公式如式（1）所示。

1.3.2 黃秋葵花多糖的一般理化特性分析

黃秋葵花多糖的一般理化特性分析參照文獻[7]進行。半乳糖醛酸質量分數的測定采用咔唑比色法。蛋白質量分數的測定采用考馬斯亮藍法。總酚質量分數采用福林-酚法測定。

1.3.3 黃秋葵花多糖的分子質量分析

黃秋葵花多糖的分子質量分析參照文獻[13]。激光光散射法可以精確分析多糖的重均分子質量（mW）及其分布和均方根旋轉半徑折光率增量dn/dc為0.138 mL/g，進樣量為200～300 μL，數據收集60 min，柱溫為室溫，流動相為0.1 mol/L NaNO3溶液（含有質量分數0.02% NaN3）。稱取3 mg樣品溶解于1 μL的0.1 mol/L NaNO3溶液中，磁力攪拌溶解4 h，過0.22 μm濾膜，備用。采用ASTRA軟件進行數據收集和計算。

1.3.4 黃秋葵花多糖的單糖組成分析

1.3.4.1 多糖組分的完全酸水解

稱取2 mg樣品于安瓿瓶中，加入2 mol/L三氟乙酸2 mL，封管，置于110 ℃烘箱中酸解8 h，待反應完全后冷卻至室溫，用氮吹儀吹干，即可得到水解后的單糖混合物。加少量蒸餾水溶解，用0.1 mol/L NaOH溶液調整樣品pH值至中性，用蒸餾水定容至1 mL備用。

1.3.4.2 PMP柱前衍生-高效液相色譜法分析單糖組成

衍生物制備：精密稱取標準單糖，等物質的量混合配制成濃度為2 mmol/L的標準單糖混合溶液。吸取400 μL標準單糖混合溶液（加乳糖作為內標）和上述水解樣品，加入450 μL的0.3 mol/L NaOH溶液和450 μL的0.5 mol/L PMP溶液，混勻，70 ℃水浴反應30 min。加入450 μL的0.3 mol/L HCl溶液，加1 mL氯仿萃取，重復兩次，取上層水層過0.45 μm水系膜，進行高效液相色譜分析。

色譜條件：XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），檢測波長250 nm，柱溫為25 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL，流動相：溶劑A為體積分數15%乙腈和0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（KH2PO4-NaOH，pH 6.8），溶劑B為體積分數40%乙腈和0.05 mol/L PBS（KH2PO4-NaOH，pH 6.8）；梯度洗脫模式：時間梯度為0 min→10 min→30 min→35 min→40 min，相應溶劑B體積分數梯度為0→15%→25%→25%→0。

多糖組分的單糖物質的量之比計算：多糖樣品中的單糖組成分析和計算方法主要是以乳糖為內標，按公式（2）計算各標準單糖的定量矯正因子fi/Luc。樣品中各單糖的物質的量之比為峰面積與內標物的峰面積比乘以fi/Luc所得，樣品的單糖相對含量以單糖的物質的量之比來表示。

式中：fi/Luc為該單糖的校正因子；Ai為標準單糖的峰面積；ni為標準單糖的物質的量/mmol；ALuc為內標的峰面積；nLuc為內標的物質的量/mmol。

1.3.5 黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜檢測

黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜檢測參照文獻[7]進行。取樣品約2 mg，置于干燥的瑪瑙碾缽中，在紅外燈干燥的條件下加入溴化鉀約0.5 g，碾勻，壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。

1.3.6 黃秋葵花多糖特性黏度分析

黃秋葵花多糖特性黏度分析參照文獻[14]進行。用蒸餾水作為溶劑，多糖樣品過夜充分溶解，分別配制得到多糖溶液作為待測液。將烏氏黏度計垂直固定于恒溫水槽內，溫度控制為（25.0±0.1）℃。移取8 mL蒸餾水加入到烏氏黏度計中，恒溫15 min。按烏氏黏度計的使用方法，測定溶劑流出時間T0。移取8 mL待測樣品溶液加入到烏氏黏度計中，恒溫15 min，測定樣品溶液流經兩刻度線間的時間，重復3 次，取平均值記為T1。依次加入4、4、8 mL的蒸餾水，稀釋混勻，使溶液濃度為初始濃度的2/3、1/2、1/3，并恒溫15 min，然后測定稀釋后溶液流經兩刻度線間的時間。每次測定重復至少3 次，最大值與最小值之間相差不得超過0.5 s，最終流出時間取3 次測量值的平均值。分別計算不同樣品溶液的相對黏度（ηr）、增比黏度（ηsp）和比濃黏度（ηsp/c）（式（3）～（5））。作圖得到Huggins方程和Kraemer方程，外推可得到共同的截距，即為特性黏度[η]。

特性黏度[η]是反映聚合物占據的流體動力學體積的參數，其值的測量在生物大分子表征中具有重要意義[24]。常用Huggins方程（式（6））、Kraemer方程（式（7））來表示聚合物溶液的黏度與濃度的關系。

式中：k是Huggins常數；k’是斜率。

[η]的大小主要取決于聚合物的分子質量和鏈剛性以及溶劑特性、溫度[25]。而當聚合物的溶劑、溫度一定時，[η]只與聚合物的分子質量有關，分子質量越大，則表現出的[η]也越大[26]。

1.3.7 多糖的體外抗氧化活性測定

采用離子交換層析純化，除去黃秋葵花多糖中的小分子雜質。將不同方法提取得到的多糖樣品溶于蒸餾水中，離心后上清液用DEAE-Q Sepharose Fast Flow分離，依次用蒸餾水、0.7 mol/L與0.8 mol/L的NaCl洗脫，收集0.7 mol/L NaCl的洗脫組分，經透析、濃縮、冷凍干燥后得到樣品備用。

1.3.7.1 FRAP測定

按照黃海智[15]的測定方法，取3.9 mL的Fe3+-TPTR復合物溶液，加入100 μL樣品，漩渦混合，在37 ℃下孵育10 min，檢測其593 nm波長處的吸光度，吸光度越高表明還原能力越強，同時采用VC作為陽性對照。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力測定

按照Imjongjaira等[16]的方法，取300 μL的DPPH溶液（0.2 mmol/L，溶于體積分數80%乙醇溶液中），加入300 μL樣品并漩渦混合，同時用VC作為對照。在避光室溫的條件下反應30 min，于517 nm波長處檢測其吸光度，記為A樣品。DPPH自由基清除率按式（8）計算。

1.3.7.3 ABTS+·清除能力測定

實驗根據黃海智[15]的方法進行測定，取25 mL ABTS儲備溶液（7 mmol/L）和440 μL過硫酸鉀溶液（140 mmol/L）混合室溫避光條件下反應12～16 h制備得到ABTS陽離子溶液。ABTS陽離子溶液用PBS（pH 7.4）稀釋，直到734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02，記為A0。取3.9 mL稀釋后的ABTS陽離子溶液，加入100 μL樣品并漩渦混合，用VC作為對照。室溫下避光反應10 min，734 nm波長處檢測其吸光度。ABTS+·清除率以空白與樣品吸光度的變化率表示。ABTS+·清除率按式（9）計算。

1.3.7.4 ORAC測定

ORAC測定根據黃海智[15]的方法并略作修改。熒光素的溶液用75 mmol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）溶解，配成終濃度100.8 nmol/L。隨后在黑底96 孔板加入25 μL的樣品或Trolox溶液和75 μL熒光素鈉溶液，將其在37 ℃下孵育15 min，再將150 μL AAPH磷酸鉀緩沖溶液（38.25 mmol/L）加入到該混合物中。充分振蕩5 s后開始檢測，發射波長538 nm、激發波長485 nm，每分鐘測定一次，在37 ℃下連續測定3 h。結果以每克干物質含Trolox的物質的量（μmol Trolox/g）表示。

1.3.7.5 CAA的測定

細胞抗氧化能力（cellular antioxidant activity，CAA）的測定參照文獻[17]。將100 μL的人肝癌細胞（HepG2）以60 000 個/孔的濃度接種到96 孔板中（黑板底透）。37 ℃培養24 h后，移除培養基，PBS洗滌一次。含有不同樣品濃度的培養基用25 μmol/L的DCFH-DA處理1 h，移除培養基，PBS洗滌一次，加入100 mL的AAPH溶液。將96 孔板放入熒光酶標儀檢測，發射波長538 nm、激發波長485 nm連續檢測1 h，每5 min檢測一次，以每100 g干物質含槲皮素物質的量（μmol QE/100 g）表示表示細胞抗氧化能力。

1.4 數據統計分析

實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示，采用Excel軟件對數據進行整理、Origin Pro 2016軟件作圖。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析和Duncan’s分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 提取方法對多糖提取率的影響

4 種提取方法的提取率由高到低分別為酶法提取（（21.90±0.14）%）、酸法提取（（15.15±0.07）%）、熱水提取（（12.60±0.2 8）%）、超聲輔助提取（（12.02±0.37）%）。通過提取率的比較可知，采用纖維素酶輔助提取的方法所得粗多糖的得率最高，表明黃秋葵花中的多糖部分與細胞壁的纖維素和半纖維素結合，纖維素酶能夠水解和破壞纖維素網絡，促進多糖的溶出，這個結果與Zhu Zhenyuan[12]和Yuliarti[18]等的研究結果一致。此外，酶法和酸法所用的提取溶劑為酸性，能夠使一部分非水溶性多糖轉化為水溶性多糖，提取率升高。熱水提取與超聲輔助提取法都以去離子水為提取劑，兩者的提取率比較接近，但超聲提取方法所用的時間比熱水提取的短。這可以歸因于超聲波的空化效應對物料的組織和細胞壁產生破壞，使物料和溶劑之間有更大的接觸面積，多糖更易溶出，提高了提取效率[19]。

2.2 黃秋葵花多糖的一般理化特性

由表1可見，提取方法對半乳糖醛酸質量分數有一定的影響，4 種不同方法得到多糖CAOFP、CEOFP、CUOFP、CHOFP的半乳糖醛酸質量分數分別為（52.63±2.13）%、（39.51±1.47）%、（31.97±1.30）%、（29.34±1.31）%，其中CAOFP的半乳糖醛酸質量分數最高。在酸性條件下，有更多非水溶性果膠多糖轉化為水溶性果膠多糖[7]，因此采用酸法和酶法提取得到的CAOFP、CEOFP半乳糖醛酸的質量分數要高于用純水作為提取劑的CUOFP、CHOFP。

4 種粗多糖中都含有除糖類物質以外的其他成分，而這些成分很可能與糖類基團是緊密相連的，如蛋白質、酚類物質等，會在提取及醇沉的過程中混入樣品。而表1中的結果顯示CUOFP中所含的蛋白質與總酚質量分數高于其他方法，可能是超聲波對黃秋葵花的細胞壁結構造成了更大的破壞，釋放出了更多的非多糖成分[18]。

表 1 不同提取方法的黃秋葵花多糖的化學組成Fig. 1 Chemical composition of polysaccharides obtained using different extraction methods

2.3 黃秋葵花多糖的分子質量

表 2 不同提取方法的黃秋葵花多糖分子質量Fig. 2 Molecular mass of polysaccharides obtained using different extraction methods

如表2所示，CHOFP和CEOFP都發現了2 個組分，表明黃秋葵花粗多糖中既含有分子質量較大的組分，也有分子質量較小的組分。CEOFP具有最高的（233.2 nm）和mW（4 780 kDa）；CAOFP多分散系數大，分布較寬，這與劉曉霞[7]的實驗結果一致。與其他3 個樣品相比，CUOFP的mW（207 kDa）相對較小，并且多分散系數接近1，說明該樣品多糖較為均一。

超聲波的空化效應不僅促進多糖的溶出，還會導致部分多糖的降解，形成分布更加平均的小分子多糖。研究表明，經一定強度超聲處理的大粒車前子多糖分子質量明顯下降，分子質量分布會變窄[20]。已有文獻報道熱水回流提取和酸法提取的黃秋葵花多糖分子質量分別為1 700、1 300 kDa，這種差異主要是由不同的實驗方法和計算方法引起的[7,21]。

2.4 黃秋葵花多糖的單糖組成

采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法檢測黃秋葵花多糖的單糖組成，通過比較標準品和樣品衍生物在色譜圖中的保留時間進行定性分析，不同提取方法得到的黃秋葵花多糖的單糖組成物質的量之比如表3所示。4 種提取方法所得的黃秋葵花多糖樣品具有相同的單糖組成，而相對含量有所不同。4 種樣品都由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖組成，這9 種單糖中主要以鼠李糖、半乳糖醛酸和半乳糖居多，這與劉曉霞[7]的實驗結果相近，說明黃秋葵花多糖是一類酸性雜多糖。其中，鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖與半乳糖醛酸一起出現表明多糖鏈上可能存在分支且分支程度與提取方法有關，CUOFP中性多糖相對含量高，說明多糖結構支化程度更高[18,22]。酸法提取對組織中纖維素、半纖維素等組分有增溶作用，因此產物CAOFP中含有更多的葡萄糖，可能就是來自纖維素的降解[23]。

表 3 不同提取方法的黃秋葵花多糖的單糖相對含量Fig. 3 Monosaccharide relative content of polysaccharides obtained using different extraction methods

2.5 黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜

圖 1 不同提取方法的黃秋葵花多糖的傅里葉變換紅外光譜Fig. 1 Fourier transform infrared spectra of polysaccharides obtained using different extraction methods

如圖1所示，4 種多糖在3 385 cm-1附近都出現了強而寬的吸收峰，這是O—H伸縮振動的結果，表明多糖的分子內和分子間均存在氫鍵。2 930 cm-1附近的吸收峰為C—H的振動。1 400～1 200 cm-1處的吸收峰為C—H的變形振動，表明樣品為多聚糖組分。1 724 cm-1的吸收峰處為酯鍵羰基（—COOR）形成的伸縮振動，其中CAOFP在此處的吸收峰比其他樣品強，但初步判斷所得的多糖為低酯多糖；1 615 cm-1附近為羧基的羰基C＝O伸縮振動，可能是羧酸或羧酸鹽。1 417 cm-1的峰是C—H變角振動峰。在1 017 cm-1處的吸收峰是糖苷鍵C—O—C非對稱伸縮振動，說明多糖中都存在吡喃環構象。在895 cm-1處的吸收峰表明多糖中存在β-構型糖。

2.6 黃秋葵花多糖的特性黏度

本實驗中，[η]CEOFP（10.63 dL/g）＞[η]CHOFP（10.55 dL/g）＞[η]CAOFP（2.33 dL/g）＞[η]CUOFP（1.94 dL/g），這表明不同提取方法影響了多糖的特性黏度，這與分子質量測定的結果相符，CEOFP的分子質量最大而CUOFP分子質量最小。Yan Jingkun等[27]研究發現超聲處理能夠明顯降低桑黃菌絲多糖的特性黏度。Kontogiorgos等[24]測得黃秋葵多糖的特性黏度范圍在0.41～2.71 dL/g，Ndjouenkeu等[28]報道黃秋葵多糖的特性黏度為7.6 dL/ g，與本實驗結果相近，但同時也反映了提取方法和原材料本身對多糖的結構特征會產生較大的影響。研究發現多糖的黏度過大，則在實際生產和加工的應用中會受到很大的限制[14]，Zhu Zhenyuan等[12]也在實驗中發現，較小的多糖特性黏度有利于其流動以及附著于腫瘤細胞，因此具有更好的腫瘤抑制活性。而經超聲提取得到的黃秋葵花多糖，特性黏度明顯下降，這對進一步的加工和利用多糖是有利的。

2.7 黃秋葵花多糖的體外抗氧化活性

圖 2 不同提取方法的黃秋葵花多糖的離子交換層析純化Fig. 2 Elution profiles of crude polysaccharides extracted by different methods

為了排除酚類、黃酮等物質對多糖抗氧化活性評價的影響，黃秋葵花多糖樣品經離子交換柱脫色，結果見圖2。經0.8 mol/L的NaCl洗脫的組分沒有多糖出現，觀察洗脫組分發現有色素出現，而經0.7 mol/L的NaCl洗脫的組分沒有色素且含有全部的多糖。將CEOFP、CAOFP、CHOFP、CUOFP除去小分子雜質后得到的多糖分別命名為EOFP、AOFP、HOFP、UOFP。

圖 3 黃秋葵花多糖的FRAPFig. 3 FRAP of okra flower polysaccharides

2.7.1 黃秋葵花多糖的FRAP圖3顯示了VC及4 種不同方法得到的黃秋葵花多糖在1～8 mg/mL下的鐵離子還原抗氧化力，多糖樣品和

VC的還原能力隨質量濃度的增加而增大，但多糖的還原能力與VC具有顯著的差距。多糖分子中含有大量的羥基基團，能夠作為電子供體，將Fe3+還原成Fe2+，從而使黃秋葵花多糖具有一定的鐵離子還原抗氧化活性。由圖3可知，UOFP的還原能力明顯強于其他3 種多糖。

Shen Shian等[29]在實驗中發現超聲提取的油茶餅多糖的還原能力明顯高于酶法、堿法、熱水提取的樣品；Li Jinwei

等[23]比較超聲提取和熱水法提取的駿棗多糖樣品，其中超聲提取的多糖的Fe3+還原力高于熱水法提取的多糖，說明在超聲提取過程中可能提取到了更多關鍵的生物活性物質或者使其發生一些結構或化學變化。

2.7.2 黃秋葵花多糖的DPPH自由基清除能力

圖 4 黃秋葵花多糖的DPPH自由基清除能力Fig. 4 Scavenging effects of okra flower polysaccharides on DPPH free radicals

如圖4所示，對于所有樣品，清除DPPH自由基的能力都具有劑量依賴關系，清除率在黃秋葵花多糖質量濃度為0.2～2.0 mg/mL的范圍內明顯上升。其中，VC的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.01 mg/mL，UOFP的IC50為（0.83±0.01）mg/mL，HOFP的IC50為（2.45±0.01）mg/mL，EOFP和AOFP的IC50都大于4 mg/mL。4 種多糖對DPPH自由基的清除能力強弱依次為UOFP＞HOFP＞EOFP＞AOFP，UOFP的DPPH自由基清除能力最強。有研究發現采用熱水浸提法從黃秋葵中提取的多糖有一定的DPPH自由基清除能力，不同組分的IC50不同，并具有劑量依賴的關系[30]。超聲提取過程中可能暴露出了更多的活性基團，其降解效應也能夠對多糖的DPPH自由基清除能力產生影響[31-32]。

2.7.3 黃秋葵花多糖的ABTS+·清除能力

圖 5 黃秋葵花多糖的ABTS＋·清除能力Fig. 5 Scavenging effects of okra flower polysaccharides on ABTS＋·

由圖5可知，所有多糖樣品ABTS+·的清除能力與質量濃度呈正相關。通過比較4 種多糖樣品的IC50可知，UOFP的ABTS+·清除效果最好，其他多糖樣品的IC50均大于8 mg/mL，且與VC相比清除能力相對較弱。與DPPH自由基清除能力實驗的結果一致，有研究表明超聲對多糖活性有積極的影響，可以有效提高多糖的自由基清除能力和體外抗氧化活性[27]。

2.7.4 黃秋葵花多糖的ORAC

4 種多糖的O R A C由大到小分別為U O F P（（151.15±1.23）μmol Trolox/g）、HOFP（（144.44±0.27）μmol Trolox/g）、EOFP（（6 1.7 5±0.5 5）μ m olT r olo x/g）、A O F P（（31.77±0.59）μmol Trolox/g）。結果表明，在適宜的條件下超聲提取可以在一定程度上提高多糖的生物活性。多糖中含有的一些極性基團對其抗氧化能力指數具有較大影響，還原能力實驗結果也同樣具有相近的結果。研究表明多糖的分子質量、糖醛酸含量、單糖組成與其抗氧化能力相關[33]。

2.7.5 黃秋葵花多糖的CAA

雖然化學抗氧化方法能夠非常有效地篩選抗氧化物質，但是它們不能準確地評價抗氧化物質在生物體內的活性。細胞抗氧化活性篩選方法涉及細胞吸收、分布和代謝，能提供更可靠的抗氧化活性的生物學評價結果，可以克服化學測定的一些缺點，成為了一種重要的抗氧化活性評價方法[34]。

多糖樣品的CAA分別為UOFP（（892.85±27.95）μmol QE/100 g）、AOFP（（473.86±18.56）μmol QE/100 g）、HOFP（（91.11±3.10）μmol QE/100 g），其中UOFP具有最好的CAA，而EOFP在實驗中沒有檢測到CAA。

3 結 論

采用了4 種提取方法：熱水提取、酸法提取、酶法提取、超聲輔助提取黃秋葵花中的多糖，分別得到CHOFP、CAOFP、CEOFP、CUOFP 4 種多糖。其中酶法提取的得率最高，為（21.90±0.14）%。4 種多糖都富含半乳糖醛酸，且含有少量蛋白質、酚類等。通過分析多糖的分子質量、單糖組成、傅里葉變換紅外光譜，結果表明得到的4 種多糖樣品都具有多糖的典型傅里葉變換紅外光譜特征；它們的單糖組成成分相同，主要由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖組成，但不同樣品的單糖物質的量之比有所不同；酶法提取和熱水提取的多糖樣品CEOFP、CHOFP分子質量和特性黏度較大，而超聲提取能顯著降低多糖的特性黏度和分子質量且使分子質量的分布變窄。

對4 種多糖的DPPH自由基清除能力、ORAC、ABTS+·清除能力、FRAP和CAA進行測定，結果表明4 種多糖具有不同程度的抗氧化活性，且具有劑量依賴性。相對于其他3 種提取方法，超聲輔助提取的多糖在實驗中均表現出了更強的抗氧化活性，說明超聲輔助提取的方法可能對多糖的生物活性產生了有利的影響。