高壓微射流處理對原花青素平均聚合度和抗氧化性能的影響

鐵珊珊，劉夢培，縱 偉*，張麗華，趙光遠

（鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002）

原花青素又稱縮合單寧，主要存在于水果和蔬菜中，例如葡萄、蘋果和洋蔥等，是人類飲食的重要組成部分[1-3]。它具有抗氧化、清除自由基、抑制低密度脂蛋白氧化、減少心肌缺血再灌注損傷等生物活性，被廣泛應用于藥物、化妝品和食品等領域[4-5]。按照聚合度的大小，通常將聚合度2～4的稱為低聚原花青素，將四聚體以上的稱為高聚原花青素[6]。低聚體可以在體內被消化吸收，而高聚體則不能，然而，產品中的原花青素主要為高聚體，導致原花青素的生物利用度極低[7-8]。

目前主要采用以下方法提高原花青素的生物利用率和產品附加值：1）將提取出來的原花青素進一步分離和富集獲得低聚原花青素，主要采用樹脂吸附分離和膜分離法，但高聚體得不到有效利用[9-10]；2）將高聚原花青素降解為低聚原花青素，主要有生物降解法以及堿性降解法、芐硫醇降解法等化學方法，但反應激烈，容易造成產品結構破壞[3,11-12]。動態高壓微射流均質技術（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是一種特殊形式的物理高壓均質技術，具有能耗低、污染少、改善多聚體結構、不同壓力作用樣品性質變化不同等優點[13-15]。Sun Cuixia等[16]研究發現采用DHPM處理玉米蛋白乙醇溶液會改變玉米蛋白的結構性質；張博[17]研究發現蠟質淀粉經DHPM處理后分子鏈發生斷裂，分子質量有所下降。而DHPM這一物理改性技術對原花青素性質的影響鮮有報道。因此，本實驗主要采用DHPM處理原花青素溶液，研究處理壓力和次數對原花青素的平均聚合度以及抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原花青素（純度≥98%） 山東康美藥業有限公司；兒茶素標準品 天津市尖峰天然產物研究開發有限公司；VC、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、香草醛等均為分析純 國藥集團有限公司。

1.2 儀器與設備

FPG12800高壓納米均質機 安盛聯合科技有限公司；XY-FD-18真空冷凍干燥機 上海欣諭儀器有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將10 g原花青素溶于蒸餾水中，定容至1 000 mL。

1.3.2 DHPM處理

采用DHPM將原花青素水溶液在不同的處理壓力（100、140、180、220 MPa和260 MPa）分別下進行1、2、3、4 次循環處理，接著將其進行冷凍干燥，獲得不同處理條件下的樣品。與未經高壓處理的樣品（對照組）進行比較分析。

1.3.3 原花青素平均聚合度的測定

準確稱量1 mg樣品，根據彭芳剛等[18]的方法測定原花青素的平均聚合度：采用傳統的香草醛-甲醇法測定原花青素的質量，以兒茶素為標準品，獲得吸光度與兒茶素質量濃度之間的線性關系為y＝0.305 7x+0.010 1，R2＝0.998 2；采用香草醛-乙酸法測定原花青素物質的量，吸光度與兒茶素物質的量濃度之間的關系為y＝1.177 3x+0.028 2，R2＝0.996 9，按照下式算出原花青素的平均聚合度。

式中：m為原花青素的質量/μg；n為原花青素物質的量/μmol；M為單體兒茶素的摩爾質量（290 g/moL）。

1.3.4 鐵還原力的測定

參照文獻[19]中的方法測定原花青素的鐵還原力。

1.3.5 清除DPPH自由基能力的測定

參照文獻[20]中的方法測定原花青素清除DPPH自由基的能力。

1.4 數據分析

采用Origin 8.5、SPSS軟件處理實驗數據，結果采用平均值±標準差表示，Duncan法分析差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 原花青素平均聚合度分析

聚合度是衡量原花青素的重要品質之一[21]。圖1為100、140、180、220、260 MPa下分別進行1、2、3、4 次循環處理前后原花青素的平均聚合度。

圖 1 處理壓力和次數對原花青素平均聚合度的影響Fig. 1 Effects of different processing pressure levels and cycles on the degree of polymerization of proanthocyanidins

由圖1可知，不同處理條件下原花青素的聚合度不同，未經超高壓處理的原花青素平均聚合度為3.85，經超高壓處理后原花青素的平均聚合度均低于2.00，兩者之間存在顯著差異（P＜0.05），可能是由于超高壓處理過程中，高聚原花青素的氫鍵等非共價鍵發生斷裂，導致原花青素的平均聚合度下降，該結論與梁瑞紅等[22]關于DHPM處理對低酯果膠分子質量的影響研究結果一致。隨著處理壓力的升高，原花青素的平均聚合度之間總體不存在顯著差異，但從其數值上來看，220 MPa下原花青素的平均聚合度相對較低；壓力為100、140 MPa時，平均聚合度隨著處理次數增加呈下降趨勢，壓力為180、220 MPa時，隨著處理次數增加，平均聚合度則無明顯變化規律，但4 次處理條件下樣品的平均聚合度最小，260 MPa下平均聚合度呈現先增加后下降的趨勢。處理壓力為220 MPa，次數為4條件下獲得的平均聚合度最低（1.32），顯著低于其他處理條件下的聚合度（P＜0.05）。

2.2 抗氧化能力分析

根據DHPM不同處理壓力和次數對原花青素平均聚合度的影響，選擇處理次數為4條件下的不同處理壓力進行抗氧化能力分析，比較其與對照組以及VC抗氧化能力之間的差異。

2.2.1 鐵還原力分析

在食品體系中，一些過渡金屬在自由基形成的過程中可以作為催化劑，其中亞鐵離子是最有效的助氧化劑，具有極高的反應活性。因此鐵還原力的測定通常用來評價天然抗氧化劑的供電子能力，可以反映樣品的抗氧化能力[23]。

由圖2可知，同一質量濃度不同處理條件下原花青素的鐵還原能力不同，隨著質量濃度的升高，樣品的吸光度增大，吸光度與樣品的還原力呈正相關，樣品的吸光度越大，表明其還原力越強[24]；在測定的質量濃度范圍內原花青素的鐵還原能力均高于VC對照品；經高壓處理的原花青素鐵還原力均高于未經高壓處理的原花青素。鐵還原能力順序為：220 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞對照組＞VC。樣品質量濃度為12.5 μg/mL和25.0 μg/mL時，處理壓力為100、140、220、260 MPa條件下的原花青素鐵還原力之間不存在顯著差異（P＞0.05）。當樣品質量濃度為50.0、100.0 μg/mL時，100、140 MPa下獲得的原花青素鐵還原力之間不存在顯著差異（P＞0.05）；當樣品質量濃度為75 μg/mL時，樣品之間不存在顯著性差異，但均高于VC的還原能力（P＜0.05）?？傊?，不同處理壓力下的原花青素鐵還原力存在一定差異。

2.2.2 清除DPPH自由基能力分析

DPPH自由基清除能力是當前檢測樣品抗氧化能力使用最為廣泛的指標，原花青素的質量濃度和抗氧化能力與DPPH自由基清除率呈正相關[25]。

圖 3 不同處理壓力下原花青素對DPPH自由基的清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of proanthocyanidins at different processing pressures

由圖3可知，不同壓力下原花青素的自由基清除能力不同，在1.0～20.0 μg/mL范圍內，對DPPH自由基清除能力呈現明顯的劑量依賴效應關系，然后隨著質量濃度的增加，DPPH自由基清除能力增速減慢；原花青素的清除能力均高于相同質量濃度下的VC對照組；經高壓處理的原花青素清除能力均高于相同質量濃度下未經高壓處理的樣品。DPPH自由基清除能力順序為：220 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞對照組＞VC。在質量濃度為1.0 μg/mL時，處理壓力為140 MPa（清除率13.13%）、180 MPa（13.23%）、220 MPa（14.48%）條件下原花青素的DPPH自由基清除能力不存在顯著差異（P＜0.05），但220 MPa下原花青素的清除能力相對較高；質量濃度為2.5 μg/mL時，100 MPa（23.47%）、140 MPa（23.92%）、180 MPa（23.84%）、220 MPa（23.90%）條件下原花青素的DPPH自由基清除能力不存在顯著差異（P＜0.05）；在質量濃度為5.0、10.0、20.0 μg/mL時，100、140、180、220 MPa下原花青素的清除能力無顯著差異，但在質量濃度為20.0 μg/mL時，220 MPa下原花青素的自由基清除能力達到90%的清除效果；在質量濃度為40.0 μg/mL時，所有樣品的自由基清除能力均超過90%，且不存在顯著差異。

2.2.3 原花青素抗氧化能力的IC50

原花青素鐵還原力半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為抑制率達到50%時樣品的質量濃度[26]。

由表1可知，700 nm波長處吸光度隨原花青素質量濃度的增加而升高，且相關系數R2值均大于0.990 0，說明還原力與原花青素質量濃度呈良好的線性關系。根據回歸方程可以得知不同樣品的IC50，220 MPa下原花青素的鐵還原力IC50為42.7 μg/mL最小，未經高壓處理的IC50最大為51.7 μg/mL，均小于陽性對照組VC的52.7 μg/mL，IC50越小表示樣品清除自由基能力越強，反之樣品清除自由基能力弱[27]；因此220 MPa下原花青素的鐵還原能力最強。

表 1 不同處理壓力下原花青素及VC的鐵還原力IC50Table 1 IC50 for ferrous ion chelating activity of proanthocyanidins at different processing pressures and VC

原花青素DPPH自由基清除能力IC50為清除率達到50%時所需要的抗氧化劑質量濃度[27]。本實驗中，原花青素DPPH自由基清除能力IC50由小到大依次為：220 MPa（6.469 μg/mL）＜180 MPa（6.929 μg/mL）＜140 MPa（7.183 μg/mL）＜100 MPa（7.481 μg/mL）＜260 MPa（7.831 μg/mL）＜對照組（7.866 μg/mL）＜VC（8.644 μg/mL）。IC50越小抗氧化能力越強，說明220 MPa下原花青素的抗氧化能力最強。

3 結 論

通過分析處理壓力和次數對原花青素平均聚合度的影響可知，DHPM處理會破壞原花青素的分子結構，使其平均聚合度降低。隨著處理壓力的增加，原花青素的平均聚合度之間雖不存在顯著性差異，220 MPa下平均聚合度相對較??；處理次數為4條件下平均聚合度最小。

固定處理次數為4，選擇不同處理壓力的樣品進行抗氧化能力分析，包括鐵還原力和DPPH自由基清除能力，抗氧化能力順序為：220 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞對照組＞VC；IC50的變化趨勢完全與其相反，處理壓力為220 MPa下的原花青素抗氧化能力最強。說明在一定范圍內原花青素的平均聚合度越小其抗氧化能力越強。