根皮苷對蘋果采后灰霉病的影響

賀軍花，馬利菁，周會玲*

（西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100）

灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的侵染性真菌病害，在果蔬采后貯藏中具有很高的發生頻率，病原菌可通過機械傷口和花期兩種途徑侵染果蔬，潛伏至貯藏中后期發病[1]，給生產者造成了嚴重的經濟損失，還形成了一定的食品安全隱患。目前控制灰霉病發生主要是使用化學殺菌劑，但化學殺菌劑會在果實表面殘留，食品安全性得不到保障，長期使用還會使病原菌產生抗藥性[2]。因此，探究蘋果自身成分對灰霉病的抑制作用并加以利用是防治灰霉病的重要解決途徑之一。

很多研究發現植物感染病原菌后體內總酚含量上升，某些單體酚含量上升尤為顯著，酚類物質含量上升很可能是植物對病原菌應答的重要機制，而單體酚是病害應答和抗病的基礎[3]。根皮苷是根皮素的葡萄糖苷，屬于黃酮類中的二氫查耳酮類物質[4]。根皮苷是蘋果屬植物中特有的一種酚類物質，大量存在于葉片、果實和種子中，提取工藝簡單，可獲得性強，具有殺菌、抗氧化、抗癌、改善記憶力、降低血糖等[5-6]多種重要的生物活力，在食品、醫療保健以及化妝品行業中廣泛應用。研究表明，根皮苷能抗植物的多種病原菌，如蘋果黑星病、火疫病等[7]，在植物生長發育以及抗逆過程中也發揮著重要作用。張澤生等[8]研究表明，根皮苷能夠增強超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力，顯著延長由高脂膳食導致氧化損傷的果蠅壽命。此外，根皮苷還可以抑制多元不飽和脂肪酸的氧化[9]，并作為平衡性核酸轉運蛋白抑制劑，起到抗癌、抗病毒和保護心血管等作用[10]。同時，根皮苷在殺菌、保護神經系統、改善記憶等方面的作用也十分顯著[11]。但有關根皮苷能否直接抑制病原菌的生長并作為外源激發子誘導植物系統抗性反應的報道較少。因此，本實驗以體外接種B. cinerea研究根皮苷的抑菌作用，并通過分析發病過程中抗性相關酶活力和相關物質含量變化，探究根皮苷對蘋果灰霉病的抑制作用，以期為根皮苷在采后病害抗性機理研究方面提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰葡萄孢（Botrytis cinerea Pers.）由西北農林科技大學植物保護學院提供。將菌種在PDA培養基上進行繼代培養，25 ℃下恒溫避光培養9 d后，用體積分數0.05% Tween-80的無菌水制成濃度約為106個/mL的孢子懸浮液備用。

‘粉紅女士’蘋果（Malus domestica‘Pink Lady’）采于西北農林科技大學白水實驗站，要求大小均勻、成熟度、著色基本一致，無機械損傷和病蟲害。

L-苯丙氨酸、二硫蘇糖醇、抗壞血酸、苯甲基磺酰氟化物（phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF）美國Sigma公司；聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸二鈉 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-LB型無菌操作臺 蘇凈集團安泰公司；BCD-236DT型冰箱 青島海爾股份有限公司；A11型液氮研磨儀 德國IKA公司；AUY220分析天平日本島津公司；5810R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；UV-1800紫外-可見分光光度計 科大中佳公司；KQ-500DB數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗處理

在離體實驗基礎上，最終確定1.0 g/L的根皮苷為活體實驗的使用質量濃度，并進行下述處理：以體積分數70%乙醇擦拭果面，晾干后放入根皮苷溶液中浸泡20 min，取出后在室溫（20±1）℃下誘導12 h，對照組用清水浸泡。用直徑3 mm的消毒釘子在蘋果赤道部位陰陽面均勻刺3 mm深的2 個傷口，在傷口處分別接種20 μL 106個/mL B. cinerea懸浮液，晾干后放入聚氯乙烯保鮮袋，室溫條件下放置。固定30 個果實，統計發病率和病斑直徑，重復3 次。其余果實，定期（0.0、0.5、1.0、1.5 d和2、3、5、7、9 d）取病斑周圍1～2 cm內健康果肉組織，用液氮迅速冷凍后磨成粉末，裝入錫箔紙袋中于-80 ℃保存，用于測定抗性相關酶活力及物質含量。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 發病率、抑菌率和病斑直徑的測定

菌落（病斑）直徑利用游標卡尺進行十字交叉法測定，取平均值。以病斑直徑大于等于3.5 mm確定為發病，發病率、抑菌率分別按式（1）、（2）計算。

1.3.2.2 PAL活力的測定

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine amonialyase，PAL）活力的測定參考Han Cong等[12]的方法，略有改動。稱取1.0 g果肉，加入2 mL 0.1 mol/L、pH 8.7的硼酸提取緩沖液（含40 g/L PVP、2 mmol/L EDTA和5 mmol/L β-巰基乙醇），冰浴條件下研磨成勻漿，于4 ℃、12 000×g離心30 min，上清液為粗酶提取液，4 ℃保存備用。取2 支試管，分別加入3 mL 50 mmol/L、pH 8.8的硼酸緩沖液和0.5 mL粗酶提取液，然后于一支試管中加入0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸，另一支加入0.5 mL的蒸餾水作為對照。將2 支試管于37 ℃溫水中保溫60 min，使生成反式肉桂酸，以0.1 mL 6 mol/L鹽酸溶液終止反應。290 nm波長處分別測定反應管和對照管的吸光度，以每小時酶促反應體系吸光度增加0.01作為一個酶活力單位，單位為U/（h·g），以鮮質量計，實驗重復3 次。

安徽地區復合肥較受農民歡迎，加上冬小麥播種影響，復合肥市場供應良好，價格相對比較樂觀。同時，受原料價格上漲影響，復合肥價格有上漲趨勢。有經銷商反映，當地農民對于新型肥料抱有一定興趣，如果經銷商能在銷售旺季做好推廣示范和知識普及，銷量有望進一步提高，經營方面的壓力也將有所緩解。

1.3.2.3 POD、PPO活力的測定

過氧化物酶（peroxldase，POD）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參考周曉婉等[13]的方法，POD活力在470 nm波長處測定吸光度，以每分鐘吸光度變化1定義為一個酶活力單位，結果以U/（min·g）表示；PPO活力在420 nm波長處測定吸光度，以每分鐘吸光度變化1定義為一個酶活力單位，結果以U/（min·g）表示。結果均以鮮質量計，實驗重復3 次。

1.3.2.4 總酚、類黃酮含量的測定

總酚、類黃酮的含量分別分別參考Toor[14]和González-Aguilar[15]等的方法測定。稱取1.0 g果肉，加入4 mL提取液（為體積分數1% HCl-甲醇，4 ℃預冷），研磨至勻漿，轉入離心管中，在4℃下提取15 min，于4 ℃、12 000×g離心30 min。取上清液分別在280 nm和325 nm波長處測定吸光度，以每克鮮果肉在280 nm和325 nm波長處的吸光度來表示，分別計作A280nm和A325nm，實驗重復3 次。

1.3.2.5 木質素含量的測定

參照周會玲等[16]的方法，以每克鮮果肉在280 nm波長處的吸光度（A’280nm）來表示，實驗重復3 次。

1.3.2.6 H2O2含量的測定

H2O2含量的測定參照Takshak等[17]的方法，在390 nm波長處測定吸光度，單位為μmol/g，結果以鮮質量計，實驗重復3 次。

1.4 數據分析

以SPSS 17.0軟件進行數據分析，用Excel 2007軟件作圖。離體實驗在ANOVA下用LSD分析法、活體實驗用標準t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 離體條件下根皮苷抑菌質量濃度的篩選

菌落是微生物在固體培養基上以母細胞為中心生長形成的可見集團，其直徑是判斷微生物生長狀況的最直觀指標。由表1可知，根皮苷處理組菌絲生長減慢，菌落直徑小于對照組，且隨著根皮苷質量濃度的增加，對B. cinerea的抑制能力也增強。接種后第3天，0.8、0.9 g/L和1.0 g/L根皮苷處理組沒有菌落形成，對照組及0.5、0.6 g/L和0.7 g/L根皮苷處理組都有發病，但根皮苷處理組的菌落直徑顯著低于對照組，抑菌率分別為38%、59%和69%（P＜0.05）。接種后第4天和第6天，0.8 g/L根皮苷處理組和0.9 g/L根皮苷處理組分別有可見菌落形成，到第9天，1.0 g/L根皮苷處理組也并未有可見菌落形成。由此可見，根皮苷能夠直接抑制B. cinerea的生長，當質量濃度達到1.0 g/L時可以完全抑制B. cinerea孢子的萌發，無菌落形成。通過預實驗篩選發現此質量濃度也是活體處理的最佳質量濃度，因此，選用1.0 g/L作為本實驗根皮苷使用的質量濃度。

表 1 根皮苷處理對體外接種B. cinerea菌落直徑的影響Table 1 Effect of phlorizin treatment on the colony diameter of B. cinerea in vitro

2.2 根皮苷對蘋果灰霉病的抑制作用

圖 1 根皮苷處理對‘粉紅女士’蘋果采后灰霉病發病率（a）和病斑直徑（b）的影響Fig. 1 Effect of postharvest phlorizin treatment on grey mold incidence (a)and lesion diameter (b) caused by B. cinerea in ‘Pink Lady’ apple fruits

發病率和病斑直徑是判斷防治效果的重要指標，可直觀體現病害的發生情況。由圖1a、b可知，根皮苷處理對蘋果采后灰霉病發病率和病斑直徑擴展有顯著的抑制作用（P＜0.05），未經處理的果實在接種B. cinerea后發病率和病斑直徑迅速增大，而處理組發病率和病斑直徑增加較為緩慢。如圖2a所示，在接種后第1天，處理組和對照組均有發病，對照組發病率接近20%，而處理組不足3%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。其后，對照組發病率持續增加，接種后第5天，發病率已接近100%，而處理組發病率僅為61.1%，相比對照組降低了38.3%，差異極顯著（P＜0.05）。至觀察后期，對照組全部發病，處理組發病率也繼續增加，但仍沒有全部發病，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。由圖2b可知，與發病率變化相似，接種B. cinerea后，對照組病斑直徑顯著高于處理組，在接種后第5天，對照組的病斑直徑就達到了11.10 mm，而處理組為9.53 mm，兩組相比差異顯著（P＜0.05）。其后，對照組的病斑直徑迅速擴大，至測量后期達25.17 mm，而處理組病斑直徑顯著低于對照組（P＜0.05），比對照減小了4.53 mm。可見根皮苷處理可以有效降低蘋果采后灰霉病的發生率，并抑制病斑直徑的擴展。

2.3 根皮苷對果實抗性相關酶活力的影響

圖 2 根皮苷處理對采后‘粉紅女士’蘋果果實抗性相關酶活力的影響Fig. 2 Effect of phlorizin treatment on resistance-related enzymes activities in postharvest ‘Pink Lady’ apples

PAL是許多中間抗菌物質生成的關鍵酶，其活力強弱常被用作植物抗性反應的重要指標。如圖2a所示，經過根皮苷處理的果實PAL活力整體較對照組高，且兩組酶活力都呈先升高后降低的趨勢。在0.5 d時，對照組和處理組都達到一個小高峰，對照組酶活力為304.9 U/（h·g），處理組比對照組約高34.2 U/（h·g），兩組差異極顯著（P＜0.01）。之后對照組和處理組的PAL活力均有所降低，在1.5 d時同時下降到一個極小值，但處理組酶活力仍較對照組高25.3%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。之后PAL活力又開始增加，并在2 d時達到峰值，后期緩慢下降，并趨于平緩。因此認為，根皮苷作為外源激發子可有效誘導蘋果果實PAL活力的增加，以更好抵御灰霉菌入侵。

POD與植物體內活性氧代謝和木質素的合成緊密相關，可消除活性氧對植物細胞的傷害并催化木質素的最后一步合成。如圖2b所示，處理組POD活力顯著高于對照組（P＜0.05），且兩組酶活力在整個時期都基本呈上升趨勢，在0.5 d時同時達到一個小峰值，之后酶活力基本保持不變，在3 d后兩組酶活力均迅速增加，處理組在7 d上升到峰值，比此時對照組酶活力高38.0%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。可見，外源根皮苷的使用可有效誘導POD活力的增加，以消除活性氧對果實細胞的傷害，并促進木質素的合成。

PPO與植物體酚類代謝密切相關，可以將多種簡單酚類物質氧化形成醌類。如圖2c所示，在整個觀察期，PPO活力整體呈現先降低再上升后下降的趨勢，且處理組PPO活力始終較對照組高。在1.5 d時處理組PPO活力達到峰值，較此時對照組的酶活力高94.4%，兩組之間差異極顯著（P＜0.01）。之后酶活力開始下降，到7 d后又有上升的趨勢。1 d時對照組PPO活力上升到一個峰值，仍然較此時的處理組酶活力低，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。因此認為，根皮苷處理可顯著誘導PPO活力的增加，促進醌類物質的積累，抵御病害的脅迫。

2.4 根皮苷對果實抗性相關物質含量的影響

圖 3 根皮苷處理對采后‘粉紅女士’蘋果果實抗性相關物質含量的影響Fig. 3 Effect of phlorizin treatment on the contents of resistancerelated substances in postharvest ‘Pink Lady’ apples

總酚和類黃酮是植物體內直接的抑菌物質，其含量的變化代表著植物對外界刺激的應答能力。經過根皮苷處理的果實中總酚含量整體高于對照組（圖3a）。在接種B. cinerea后，處理組總酚含量上升較快，1.5 d達到一個峰值，此時處理組的總酚含量極顯著高于對照組（P＜0.01）。之后處理組的總酚含量有所下降，5 d時出現一個極小值，然后呈上升-下降的波動趨勢。而對照組總酚含量整體呈緩慢上升的趨勢，在后期略有下降，再緩慢上升，至觀察末期仍有上升的趨勢。

如圖3b所示，與總酚含量變化相似，根皮苷處理組的類黃酮含量整體較對照組高，且處理組和對照組類黃酮含量總體呈現先升高后降低再升高的趨勢。處理組類黃酮含量在最初就較對照組高，其后兩組類黃酮含量都有所增加，至接種1 d，處理組類黃酮含量達到一個峰值，較此時對照組類黃酮含量高18.0%，之間差異極顯著（P＜0.01）。其后處理組和對照組類黃酮含量都有所下降，但處理組含量仍較對照組高。在2 d時，處理組和對照組類黃酮含量都下降到一個較低水平，之后又開始上升，雖然對照組較處理組上升快，但之間并無顯著差異（P＞0.01）。由此可見，根皮苷處理可有效增加果實體內總酚和類黃酮的積累。

木質素作為植物防御系統的重要組成成分，在強固細胞壁和增加抗性上起十分重要的作用。經過根皮苷處理的果實木質素含量在整個觀察期都較對照組高（圖3c），兩者都是先升高到一個峰值，再下降后又升高。根皮苷處理組在1.5 d時木質素含量積累到一個最大水平，比此時對照組木質素含量高約69.5%，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。其后木質素的積累逐漸減少，在第5天減少到一個極小值后又開始增加，并在觀察末期達到與峰值接近的水平。對照組在2 d時達到一個極大值，之后迅速下降，第5天開始，木質素含量又快速積累，至第9天時上升到一個略低于處理組的水平。可見根皮苷處理可有效增加果實木質素的含量，以更好抵御灰霉病入侵。

植物在受到不良環境脅迫時，體內迅速積累H2O2參與抗逆反應的啟動和誘導過程，直接或間接導致膜脂過氧化，加速細胞的衰老和解體。如圖3d所示，處理組和對照組H2O2含量整體呈現先上升后下降的趨勢，且處理組H2O2含量整體較對照組低。接菌后處理組H2O2含量開始上升，在1 d時達到峰值，與此時對照組的H2O2含量基本相同，之后處理組H2O2含量開始下降，而對照組繼續上升，在1.5 d時達到一個峰值，較此時處理組含量高4.40 μmol/g，兩組之間差異極顯著（P＜0.01）。其后處理組和對照組H2O2含量都呈現上升-下降的波動趨勢。因此認為，根皮苷處理可有效降低H2O2的生成，降低膜脂過氧化程度，減緩果實的衰老死亡過程。

3 討 論

外源黃酮類物質處理蘋果果實可以有效減弱灰霉菌的致病能力，降低損傷接種B. cinerea果實的發病率和抑制病斑直徑的擴展，并誘導果實中防御相關酶類活力的升高和抗性相關物質含量的增加[18]。根皮苷是黃酮類物質的重要組成成分，作為殺菌劑和抗氧化劑而廣泛應用。通過體外實驗研究發現，培養基中所含根皮苷質量濃度與B. cinerea的生長呈負相關（R2＝0.959）。隨著根皮苷質量濃度的增大，對B. cinerea的抑制效果越明顯，B. cinerea菌落形成的時間延遲，直徑減小。當根皮苷質量濃度達到1.0 g/L時，培養基上無B. cinerea菌落的形成。由此可見，1.0 g/L的根皮苷可完全抑制B. cinerea的生長。通過活體實驗研究發現，1.0 g/L的根皮苷溶液浸泡處理可有效降低‘粉紅女士’蘋果果實發病率，抑制病斑直徑擴展，顯著改善果實發病情況。在剛接種B. cinerea時，果實表面附著的根皮苷和滲透進入果肉淺表面的根皮苷可接觸B. cinerea，對其起直接毒殺作用，在一定程度上可抑制病原菌在果實上的定植生長。隨著接種時間的延長，病原菌在果實上生長繁殖，其侵染范圍由近及遠、由外而內，根皮苷的這種直接毒殺效果減弱，B. cinerea的入侵速率較初期顯著增加（P＜0.05），但處理組的病斑直徑仍然低于對照組，可見根皮苷處理能夠顯著改善果實灰霉病的發生情況。

PAL作為非特異酶參與了由多途徑激發子誘導植物的抗性反應，可增強植物對不良因子的抵御能力[19]。本研究發現根皮苷處理組PAL活力整體較對照組高。在接菌0 d時，處理組的果實PAL活力較對照組高7.33%，之間差異顯著（P＜0.05）。可見，根皮苷處理可直接誘導PAL活力增加，與病原菌的侵染與否無關。根皮苷對蘋果果實的這種誘導反應可在B. cinerea剛入侵時有效減緩B. cinerea的侵染速率。之后，處理組PAL活力整體仍較對照組高，可能一方面是根皮苷的繼續誘導作用，另一方面是果實本身對病原菌入侵的系統抗性反應；而對照組酶活力的改變僅僅依靠果實的系統抗性反應，因此顯著低于處理組的酶活力（P＜0.05）。這與以外源激發子處理甜瓜的結果相似[20]。PAL作為苯丙烷代謝途徑的第一關鍵酶，活力的改變是植物誘導抗性反應的重要表現之一[21]，其下游途徑產生的酚類和類黃酮具有殺菌、抗病毒、清除自由基等多種生物活性，參與果實的防御反應[22]。但植物體本身的酚類物質含量與抗性并不直接相關，誘導產生的酚類物質的變化與抗病性密切相關[23]。本實驗研究發現，在實驗處理初期根皮苷處理組和對照組的總酚含量無顯著差異，而類黃酮的含量差異顯著（P＜0.05）。可能是附著在蘋果果實表面的根皮苷通過氣孔和細胞間隙進入果肉的淺表層，而取樣部位在靠近果面1～2 cm的深度，滲透進果肉淺表皮的這部分根皮苷剛好處于取樣范圍；因此，在接種0 h時，處理組的類黃酮含量就顯著高于對照組（P＜0.05）。接菌后，處理組和對照組PAL活力改變，影響總酚和類黃酮的合成過程，而PPO活力的改變，使總酚和類黃酮氧化生成醌類物質，再經過非酶聚合反應生成黑色素[24]的過程發生變化，這兩個酶協同作用使得總酚和類黃酮的積累改變，果實的抗性能力隨之改善。這與前人研究獼猴桃[25]、柑橘[26]上的誘導抗性反應結果表現一致。可見，外源激發子處理能夠有效誘導植物體PAL和PPO活力的改變，調節總酚和類黃酮合成代謝途徑，從而使植物抗病能力增加。

POD在木質素合成中起重要的作用，催化了木質素最后一步的合成[27]，并在活性氧代謝中也發揮了重要作用，可有效消除活性氧對細胞膜脂的傷害，減緩細胞的衰老死亡過程。侯琿等[28]研究發現經過草酸、水楊酸和苯并噻二唑處理后甜瓜體內的POD活力上升十分顯著，植物體的抗性增加。本研究發現，根皮苷處理組POD活力始終保持在一個較對照組高的水平，從而促進了木質素的合成，阻礙病原菌的繼續入侵，并有效降低了H2O2的積累，減弱了果實細胞膜脂過氧化程度。接種B. cinerea后，根皮苷處理組和對照組POD活力開始上升，促進木質素的積累，從而抑制病原菌生長，干擾外多聚半乳糖醛酸的降解，并使侵入的菌絲木質化[29]，但對照組POD活力和木質素含量始終低于處理組（P＜0.05）。活性氧的產生是植物接受逆境信號的首要表現，可破壞植物細胞膜以及蛋白質和核酸的結構，造成植物體的不可逆傷害[30]。Huan Chen等[31]研究發現，經過熱激處理的桃果實中H2O2含量明顯減少，對果實細胞的傷害也降低，果實的抗性得到改善。本研究發現，在接種B. cinerea后，H2O2的含量在接種后初期呈直線上升趨勢，但處理組的H2O2含量低于對照組，主要是處理組POD活力較對照高，將H2O2分解的速率較快，膜脂過氧化程度低于對照組，果實細胞的衰老死亡過程也較對照組緩慢。因此認為，外源根皮苷處理有效誘導了POD活力的改變，從而促進木質素的合成積累，增加果實的物理抗病能力，并減少H2O2的積累，降低了H2O2對果實細胞膜脂的傷害，延緩了果實細胞的衰老凋亡過程，從而改善了果實的抗病能力。

4 結 論

根皮苷對灰霉菌具有直接的抑制作用，1.0 g/L根皮苷可以完全抑制灰霉菌的生長，同質量濃度根皮苷可作為外源激發子顯著降低果實的發病率，抑制果實病斑直徑的擴大，并有效誘導了抗性相關酶PAL、POD和PPO活力的變化，從而增加了總酚、類黃酮和木質素的積累，顯著降低H2O2的含量。通過這一系列防御酶和防御物質的變化，協同作用于病原菌，從而改善果實的抗病能力，防預果實病害的發生。