蛋白質酶法改性研究進展

王 迪，代 蕾，高彥祥*

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

蛋白質是生命的物質基礎，是人體所需的重要營養物質。此外，蛋白質的功能特性也在工業生產中發揮重要作用。一般來說，蛋白質功能特性主要包括水合作用、表面活性和蛋白質之間的相互作用等方面。水合作用主要通過蛋白質的肽鍵和氨基酸側鏈與水分子的相互作用實現，影響著水合性質，即分散性、潤濕性、溶解性、持水性、黏度和凝膠特性等。蛋白質屬于兩親分子，可以吸附在水-油界面或水-氣界面，其表面活性主要體現在表面張力、乳化性、起泡性上。蛋白質之間的相互作用主要影響蛋白質構化和凝膠作用。蛋白質多種重要的功能取決于蛋白質分子結構的多樣性，包括氨基酸的種類、數目、排列順序和肽鏈空間結構。此外，環境因素變化和加工處理方式都會對蛋白質功能特性產生一定影響。對蛋白質進行改性，可以改善其功能特性、營養價值以及產品感官質量。

目前，蛋白質改性方法主要包括物理改性、化學改性、酶法改性及基因工程改性。物理改性方法主要是利用機械振蕩、超聲、電磁場、射線和熱處理改變蛋白質空間結構或聚集方式，從而改善其功能特性，通常不影響蛋白質一級結構[1]。化學改性和酶法改性是目前蛋白質改性技術中應用最為普遍的方法。化學改性通過化學試劑使部分肽鍵斷裂或引入新的功能基團，主要包括酰化作用、去酰化作用、酯化作用、磷酸化作用、糖基化作用、氧化作用及共價交聯作用等[2]。化學改性雖然可以對蛋白質分子結構進行有效地修飾，但其工藝相對復雜；另外，不可忽視的是化學試劑及其反應產物帶來的安全性問題。相比之下，酶法改性反應步驟簡單、條件溫和、專一性強、反應程度易控制、副反應少，因此具有廣闊的應用前景。

隨著酶制劑產業和生物工程技術的發展，酶的種類越來越多，其品質也明顯提高，酶催化改性蛋白質的研究也更加深入。酶法改性主要包括對蛋白質進行水解、交聯或共價接枝，表1為幾種酶法改性蛋白質的典型例子。從酶的種類來看，主要有蛋白酶、轉谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）等；從蛋白質分子水平上看，主要包括蛋白質分子中多肽鏈的斷裂、分子內或分子間交聯或對蛋白質分子側鏈基團進行修飾，從而使蛋白質分子的組成、空間結構及理化性質發生變化，進而影響其功能特性。

1 酶法水解

蛋白質可以在酸性、堿性或酶的作用下發生水解，生成多肽或氨基酸。酸水解蛋白質是水解蛋白質的經典方法，一般利用鹽酸在一定溫度下水解一段時間后再用堿進行中和。酸水解法成本較低、操作簡易、反應迅速、水解程度高，且產物幾乎不被消旋，但是酸水解會破壞色氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺等敏感氨基酸，部分糖也會被破壞，導致水解液顏色呈現棕黑色，最重要的是酸水解蛋白原料過程會產生具有毒性和致癌性的氯丙醇[11]。堿法水解蛋白質色氨酸穩定，但水解后氨基酸會消旋。相比之下，酶法水解安全性高、反應條件溫和、具有專一性、副反應少，不破壞敏感氨基酸，能夠保留原料風味，其諸多優點使酶法水解逐漸成為水解蛋白質的趨勢。對蛋白質進行水解，可以改善蛋白質的營養價值和功能特性，降低蛋白質的分子質量，提高其溶解性等[12-13]。酶法水解植物蛋白所用的酶包括內切蛋白酶和外切蛋白酶，常用的酶有中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和一些微生物酶等。

酶水解改善蛋白質的功能特性主要與3 個方面直接相關，包括蛋白質分子質量的下降、可電離基團的增加、疏水基團的暴露[14]。Adler-Nissen等[15]總結了一系列酶水解蛋白質增加其溶解性的實例，討論了蛋白質溶解性與酶水解蛋白質程度的關系。Jamdar等[16]研究了堿性蛋白酶水解花生分離蛋白及不同水解程度對花生分離蛋白水解產物特性的影響，發現當水解程度大于10%時，溶解性明顯提高，隨著水解程度的增加，其抗氧化性和螯合金屬離子的能力提高，但其乳化性和起泡性都有所下降。Zhao Guanli等[17]研究了堿性蛋白酶限制酶水解花生分離蛋白對其構象和功能特性的影響，結果表明花生球蛋白的酸性亞基對堿性蛋白酶最敏感，其次是伴花生球蛋白，最后是花生球蛋白的堿性亞基；另外，酶水解增強了花生球蛋白的熱穩定性，花生水解蛋白的二硫鍵增加，硫氫鍵減少；內源熒光光譜分析表明花生分離蛋白三級結構易發生改變；另外水解后其溶解性、凝膠特性均有所提高，但其乳化能力有所下降。

表 1 酶法改性蛋白質舉例Table 1 Examples of enzymatic modification of proteins

酶法水解蛋白質不僅可以得到理化性質和功能特性優良的水解產物，也在營養及醫藥方面極具價值。研究表明，蛋白質在人體中主要以肽類和氨基酸的形式被吸收，且同等條件下，短鏈肽（二肽或三肽）相比于等量的氨基酸能被更有效地吸收[18]。大豆具有公認的營養價值，但其致敏性也不容忽視，Meinlschmidt等[4]研究了不同的蛋白酶對大豆致敏源（大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白）的降解效果，并探討了酶水解對感官特性的影響，結果表明酶解是減少大豆蛋白致敏性的有效途徑，而水解產物苦味特征的減少可以通過選擇適當的蛋白酶來實現，木瓜蛋白酶既可以有效降低其致敏性，又可以適當提高其感官特性。另外，研究表明，乳清蛋白水解產物表現出血管緊張素轉換酶抑制活性，具有一定的降血壓作用[5,19-21]。

利用不同的酶在一定條件下對蛋白質進行一定程度的水解，可以得到含有特定氨基酸的短鏈肽或氨基酸混合物，調整蛋白質的理化性質、功能特性及營養價值，要得到理想的水解產物，必須考慮蛋白質原料種類與濃度、水解酶的種類與濃度、水解過程條件、蛋白質水解程度等因素。

2 酶法交聯

共價交聯可以使蛋白質改性，改性后的蛋白質的某些功能特性如塑性、持水性、溶解性等得到改善，保護了食品中的某些敏感氨基酸免受各種化學反應的破壞，形成抗環境壓力的蛋白膜；另外，可通過酶共價交聯變性在非熱條件下形成凝膠；亦或將某些必需氨基酸通過共價交聯引入蛋白質，提高其營養價值。通過一些化學反應或利用催化劑可以在蛋白質分子內部或蛋白質分子之間引入交聯鍵，可以調整蛋白質的組織結構和功能特性。通過化學反應進行交聯主要包括美拉德反應產生的交聯、通過誘導產生二硫鍵進行的交聯、堿性條件下的脫氫蛋白質交聯或利用化學試劑（戊二醛）進行的交聯。酶法交聯涉及的酶主要有TGase、PPO、POD、脂肪氧化酶（lipoxidase，LOX）、葡萄糖氧化酶等。

2.1 TGase交聯反應

TGase是由331 個氨基組成的相對分子質量約38 000的具有活性中心的單體蛋白質酰基轉移酶，它針對蛋白質的酰胺基，催化親核反應，從而引發蛋白質或多肽之間的共價交聯。TGase催化反應時主要利用蛋白質谷氨酰胺殘基上的γ-甲酰胺基作供體，可利用分子內或其他分子肽鏈中的賴氨酸殘基中的?-氨基作為受體，也可利用伯氨基或者水作為受體進行共價交聯反應，其催化反應如圖1所示[22]。通過TGase催化交聯反應既可形成蛋白質高分子網狀結構，使產品的質構或流變學特性發生改變；也可以引入其他蛋白質、肽類及小分子氨基酸提高產品營養價值；或使谷氨酰胺殘基脫氨基形成谷氨酸殘基，影響蛋白質等電點及溶解性。

圖 1 TGase催化反應示意圖Fig. 1 Covalent reaction induced by transglutaminase

目前，TGase已經廣泛被應用于乳清蛋白、β-乳球蛋白、大豆分離蛋白、酪蛋白、小麥蛋白之間的共價交聯。酸奶中牛奶蛋白在利用TGase進行誘導交聯之前常常需要加熱使蛋白質結構舒展，將TGase和谷胱甘肽加入到牛奶中，發現在巴氏殺菌之前不需要加熱前處理即可以利用TGase誘導蛋白質形成凝膠網絡結構，對酶進行滅活后再進行發酵，基本不會對酸奶品質產生負面影響，且利用TGase和谷胱甘肽誘導后的酸奶黏度和蛋白質聚集程度比未加谷胱甘肽僅利用TGase誘導的酸奶大[23]。Wu Xiaoli等[24]研究了β-乳球蛋白及其凝膠在TGase誘導下及二硫蘇糖醇影響下形成凝膠的行為，發現TGase誘導β-乳球蛋白纖維時無需二硫蘇糖醇，而誘導β-乳球蛋白時需要二硫蘇糖醇還原二硫鍵，使蛋白質分子構象充分舒展，暴露TGase誘導交聯的位點；另外該研究發現相比于β-乳球蛋白，TGase誘導其纖維形成凝膠時臨界膠束濃度更低。Wang Wenqiong等[25]將TGase用于從奶酪生產過程中回收乳清蛋白，研究發現交聯乳清蛋白回收率大大提高。Yang Min等[26]研究了TGase誘導牦牛乳酪蛋白和奶牛乳酪蛋白交聯對蛋白質溶解性、乳化性、起泡性和在金屬離子環境下的穩定性等功能特性的影響，發現在相同TGase濃度下二者交聯程度不同，但功能特性的變化相似，由于酪氨酸聚合蛋白質乳化性提高并且有效提高其穩定性，但溶解性下降。

2.2 PPO交聯反應

PPO是一類含銅的氧化還原酶，可以催化鄰-苯二酚氧化成鄰-苯二醌，也可以用于單酚單加氧酶的底物，生成鄰-苯二酚，繼而氧化為鄰-苯二醌。PPO在自然界中分布較廣，普遍存在于植物、昆蟲和微生物中。PPO主要可分為三大類：單酚單氧化酶（酪氨酸酶，EC.1.14.18.1）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶，EC.1.10.3.2）和漆酶（EC.1.10.3.1）。蛋白質共價交聯主要利用酪氨酸酶和漆酶。酪氨酸酶可以使蛋白質中的酪氨酸殘基氧化為醌，也能與半胱氨酸、色氨酸、賴氨酸和組氨酸殘基反應，一方面引發了蛋白質交聯，另一方面減少了蛋白質中必需氨基酸的含量[27]。漆酶是單電子氧化還原酶，其作用機理主要是在底物自由基的形成及與漆酶中的銅離子協同作用。漆酶既可以將酪氨酸殘基氧化為醌進行蛋白質交聯，也可以將蛋白質中的巰基氧化為二硫鍵。蛋白質中的酪氨酸基團被氧化形成醌后可以與活性氨基發生邁克爾加成或席夫堿加成（圖2）。

圖 2 酪氨酸酶/漆酶對蛋白質進行催化反應Fig. 2 Catalytic reaction of protein by tyrosinase/laccase

研究證明，可以利用酪氨酸酶誘導α-乳白蛋白和β-乳球蛋白形成凝膠網絡結構，這些研究優化了酪氨酸酶誘導兩種蛋白質的最適條件，通過證實該催化反應不同的反應機理和反應位點說明酪氨酸酶誘導蛋白質形成凝膠可能是代替傳統TGase誘導蛋白質交聯的一種可行方法[28-29]。Isaschar-Ovdat等[30]研究了酪氨酸酶誘導大豆球蛋白與咖啡酸共價交聯對乳液穩定性的影響，采用了先誘導蛋白質形成凝膠再與油相均質制備乳液或先均質再誘導形成凝膠兩種方法，研究證明，后者制備出的水包油乳液更加穩定，且利用熒光顯微鏡顯示導致凝膠形成的主要是共價鍵。此外，Isaschar-Ovdat等[31]利用酪氨酸酶誘導和加熱兩種方式制備大豆球蛋白凝膠，研究發現，相比于熱誘導形成的凝膠，通過酶誘導形成的凝膠硬度大、彈性小，且酶誘導凝膠結構更加有序，其孔徑較大。Xu Ruoyang等[32]利用傳統戊二醛誘導和酪氨酸酶誘導兩種方法制備酪蛋白酸鈉納米顆粒，相比于利用大量有毒化學試劑的化學誘導法，僅用少量的酪氨酸酶配合使用少量多酚即可誘導形成完整的酪蛋白酸鈉納米顆粒，且該顆粒可以抵抗一定的環境壓力。Sato等[33]研究了不同pH值下，漆酶和阿魏酸對酪蛋白酸鈉包埋的水包油乳液的影響，結果顯示pH值對酪蛋白酸鈉包埋的乳液影響很大，漆酶誘導酪蛋白酸鈉可以提高其乳化性，并改變其穩定乳液的機理。

2.3 POD交聯反應

POD是由單一肽鏈與一個鐵卟輔基結構形成的血紅蛋白酶，是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的氧化還原酶，可催化過氧化氫、氧化酚類、胺類化合物、雜環化合物和一些無機離子。含鐵的POD包括正鐵血紅素過氧化物酶（主要存在于植物、動物和微生物中）和綠過氧化物酶（主要存在于動物器官和乳汁中），而黃蛋白過氧化物酶是一類以黃素腺嘌呤二核苷酸作為輔基的酶，主要存在于動物組織和微生物中。

辣根過氧化物酶是一種重要的POD，在過氧化氫存在時催化底物發生氧化還原反應。Dhayal等[10]利用辣根過氧化物酶和過氧化氫誘導α-乳白蛋白形成蛋白納米顆粒，相比于其他酶誘導蛋白質形成納米顆粒的方式，由于反應需要加入過氧化氫，可以通過過氧化氫控制蛋白質納米顆粒的尺寸與形貌，結果發現該方法誘導的蛋白質凝膠顆粒形貌均勻、尺寸適中，可用于制備Pickering乳液。Steffensen等[34]利用灰蓋鬼傘過氧化物酶（Coprinus cinereus peroxidase，CIP）催化含有酪氨酸的多肽，該反應通過氧化得到酪氨酰自由基中間產物，這些自由基通過鏈式反應進一步聚合，最后形成酪氨酸多肽的聚合物，該聚合反應證明CIP可以作為蛋白質結構工程的改性工具，誘導改性生物大分子形成，改善其理化性質和功能特性。

除以上介紹的幾類主要酶外，一些氧化酶也可以誘導蛋白質交聯，如LOX、葡萄糖氧化酶等。LOX由單一的多肽鏈組成，是一種含非血紅素鐵、不含硫的蛋白質，專一催化具有順,順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸加氧反應，氧化生成具有共軛雙鍵的過氧化衍生物，能直接與食品中的蛋白質和氨基酸結合，豆制品的腥味、苦澀味和LOX有關。葡萄糖氧化酶可以催化生面團麥谷蛋白中的巰基形成二硫鍵，改善產品質構[35]。這些酶交聯方法反應低毒環保、反應過程簡單、條件溫和、反應易控制且成本可接受，酶誘導形成的蛋白質共價交聯網狀結構相對二硫鍵、靜電作用、氫鍵等形成的交聯網狀結構抵抗外界環境壓力的能力更強，且能夠提高蛋白質產品的營養價值或感官品質。值得注意的是，一些加工過程會由于酶誘導蛋白質交聯產生不期望的副反應；另外，由于酶的高效性可能造成過度交聯，從而降低蛋白質營養價值，需要盡量避免這些酶誘導，為產品帶來不良影響。

3 酶催化多酚-蛋白質接枝

利用酶催化誘導可以將具有特異功能活性的小分子接枝到蛋白質上，增加其營養品質或功能特性。植物多酚種類眾多，包括酚酸類、類黃酮類以及1,2-二苯乙烯和木酚素類等。植物多酚具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗癌、抗腫瘤的活性，還有一定的抑制肥胖功能。多酚類物質與蛋白質交聯，賦予蛋白質新的功能特性，這類研究中，利用較多的是阿魏酸、綠原酸、沒食子酸、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、咖啡酸、香草酸等多酚類物質。酶催化多酚類物質與蛋白質共價的主要機理是酶（或配合氧氣）將多酚的酚羥基氧化為醌，醌可以與蛋白質氨基酸殘基中的氨基或巰基反應，形成C—N或C—S共價鍵[36]。醌類化合物易受到蛋白質中的賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸等氨基酸中親電基團的攻擊。

Aljawish等[37]利用漆酶誘導阿魏酸和肌肽，在溫和反應條件下合成了兩種分子質量相同但結構具有差異的羥基肉桂酰基肽，研究發現每個衍生物分子含有1 個肌肽和3 個阿魏酸分子，該衍生物具有抗氧化活性和抑制腫瘤細胞增殖的活性。Vate等[38]研究了利用酪氨酸酶誘導蛋白質和單寧酸形成凝膠網絡結構對沙丁魚魚糜制品的影響，該凝膠結構更加致密，含水量少，魚糜制品凝膠特性提高。

4 酶改性蛋白質的應用

目前，水解蛋白在食品工業中較多，利用蛋白質水解產物調整食品質構及增強風味的性能，將其添加到肉制品當中，亦或直接制成調味品；也可利用其優良的乳化性能及消化吸收特性，將其添加到乳品飲料或營養口服液當中；利用其水解產物對某些疾病的預防、減少過敏反應作用以及一定的抗氧化活性，將其用于醫藥行業、特殊膳食的配方及減肥產品中；還有利用酶法提取植物油的研究[39-42]。在水解動物蛋白的應用中，牛奶蛋白是一類重要的蛋白原料，其中，利用食品級蛋白酶水解乳清蛋白和酪蛋白的應用較廣泛[43-44]。利用堿性蛋白酶水解乳清蛋白制備脂肪代替品，并將其添加到冰淇淋中，可以獲得感官指標較佳的低脂冰淇淋[45]。采用胰蛋白酶和高壓微射流對花生蛋白進行改性，改性后的花生蛋白乳化性得到改善，制備的乳狀液穩定，可以將改性蛋白作為乳化劑和壁材應用到微膠囊粉末的制備中[46]。近年來，植物蛋白也被應用在一些配方食品中，一些關于植物蛋白水解產物作為功能食品或風味物質的研究逐漸被進行商業應用，例如應用在液體食品、能量補充飲料、低敏性食品和一些治療某些疾病的藥品中[47]。利用堿性蛋白酶水解黑豆分離蛋白，水解產物在口服葡萄糖耐量實驗中顯著降低餐后葡萄糖水平，且呈劑量依賴性降低糖尿病大鼠的血糖水平，水解物可能有助于控制糖尿病患者的糖尿病水平[3]。

蛋白質交聯主要應用在改善食品的營養品質和感官特性上：一方面利用蛋白質交聯可以減少某些敏感氨基酸在食品加工過程的流失或加入新的必需氨基酸以彌補天然蛋白質成分的不足；另一方面利用蛋白質交聯調節食品的組織結構或通過交聯植物蛋白模仿肉制品。TGase是一種優良的肉制品改良劑，可以促進肉類中肌球蛋白的谷氨酰胺和賴氨酸殘基發生共價交聯，促進了肉制品和魚糜制品中凝膠網絡的形成，增加凝膠網絡的強度和穩定性，提高肉制品品質。火腿腸等肉制品加工過程中加入TGase可以改善肉質的彈性和出品率[48]。另外，TGase也可以催化面筋蛋白的相互作用，在烘焙制品或速凍制品中形成穩定的蛋白質網狀結構，改善了面團的流變學特性。近年來，TGase在乳制品、植物蛋白質制品以及食品蛋白膜中被廣泛應用。研究發現，采用TGase制備的花生蛋白膜結構更致密，內部孔徑小，拉伸強度、斷裂伸長率和阻氧能力均得到提高[49]。漆酶配合一些食品級的多酚加入到酸奶中，可以使牛奶蛋白發生交聯，改善酸奶的流變學特性，提高其抗剪切能力[50]。采用酪氨酸酶制備絲素蛋白膜和絲素蛋白-殼聚糖復合物，絲素蛋白經過酶處理后分子質量顯著提高，形成的絲素蛋白膜具有良好的耐水性和較高的斷裂強度；加入殼聚糖的復合物具有良好的抑菌活性[8]。

小麥加工時其中麥谷蛋白和醇溶蛋白形成的面筋三維蛋白質網狀結構直接影響了面團品質和烘焙產品質量。Tilley等[51]研究發現小麥加工過程中面筋的形成不僅與二硫鍵相關，其中POD或POD類似物對麥谷蛋白和醇溶蛋白中酪氨酸進行氧化催化形成共價鍵也對面筋網絡結構產生重要影響。

目前，蛋白質-多酚共價接枝還主要停留在研究層面，未廣泛實際應用及大批量產品生產。蛋白質和多酚的相互作用被認為是酒水、飲料出現渾濁和沉淀的重要原因之一，更傾向于利用一些氧化酶分解蛋白質，或內源PPO、過氧化氫酶使多酚聚合，以減少蛋白質-多酚的相互作用。

5 結 語

酶法改性蛋白是提高蛋白質營養價值、功能特性和感官品質的重要途徑，且安全性優于化學改性，已逐步應用于生產實踐。隨著酶制劑產業的發展，酶的品種不斷增加、品質也逐步改善，其應用范圍也更加廣泛。然而，需要尋找更多新的蛋白質作為蛋白質酶法改性產物應用的原料；需要提高改性后蛋白質產物的適口性，同時又保證其營養價值及安全性；目前酶改性研究較多，但主要在實驗室研究水平上，而實際應用較少，這些研究成果亟待轉化為生產力；深入研究蛋白質原料亦或蛋白質改性產物的致敏性；加強蛋白質改性研究者與醫療人員的溝通，開發更有效的營養產品和藥品。酶改性蛋白技術逐步發展、完善，其研究與應用前景十分廣闊。