油桐花水提取物干預燒傷大鼠Bcl-2、Bax表達的研究

貴陽中醫學院，貴州 貴陽 550002

中醫認為燒燙傷屬于“燙火傷”范疇，常因外襲火毒，灼潰皮膚，皮肉焦卷，疼痛難忍甚至傷筋動骨，有些患者因火毒內攻，出現較重的全身癥狀[1]。油桐花具有消腫、鎮痛、止血、生肌、促進傷口愈合等作用[2]，在燒燙傷治療方面，有很好的療效[3-4]。作為凋亡家族中最主要成員，Bcl-2與Bax在燒傷中也有重要作用[5-6]。但目前未見桐子花水提物調節Bcl-2與Bax表達干預燒燙傷相關文獻報道。實驗擬通過油桐花水提液調節凋亡蛋白Bcl-2、Bax干預燒燙傷，初步確定油桐花對燒燙傷的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級Wistar雄性大鼠60只，體重(150±20)g，適應性喂養一周，購于長沙市天勤生物技術有限公司，動物許可證編號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥品與試劑 油桐花采自貴州省遵義市正安縣并由貴陽中醫學院孫慶文教授鑒定，無水乙醇(批號：20150601，重慶川東化工集團有限公司)，二甲苯(批號：20150508，重慶茂業化學試劑有限公司)，燒燙傷膏(批號：20150601，長春海外制藥集團有限公司)，蘇木素染色液(批號：AR1180-1，博士德生物有限公司)，伊紅染色液(批號：AR1180-2，博士德生物有限公司)，Elisa檢測試劑盒(批號：CK-E30187R，上海研輝生物科技有限公司)。

1.3 主要儀器 FW177中草藥粉粹機(天津市泰斯特儀器有限公司)，DZKW-4水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)，FA2204N電子天平(上海箐海儀器有限公司)，BCD-219冰箱(上海上菱白富樂)，RE-5210旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，KD-BM組織包埋機(浙江金華科迪)，XSZ-HS3生物顯微鏡(重慶光學儀器廠)，YD-335石蠟切片機(浙江金華益迪醫療設備廠)。

2 方法

2.1 藥材處理 將采摘的新鮮油桐花曬干，再用粉碎機將其粉碎，裝在塑料袋中封存，備用。

2.2 油桐花水提物制備 精取油桐花粉末25 g，裝入盛有250 mL蒸餾水的圓底燒瓶，浸泡30 min，酒精燈加熱回流2 h，紗布過濾3次，合并3次濾液，并將紗布中殘留的液體壓出。將濾液倒入蒸發皿中，水浴鍋加熱濃縮。按照上述步驟依次提取濃縮制得不同濃度(0.1g·mL-1、0.3 g·mL-1、0.6 g·mL-1)油桐花水提物，即高、中、低劑量組。

2.3 分組及造模 實驗大鼠適應喂養一周，隨機分為6組，分別為正常組、模型組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。按照“從左到右，從上到下”標記，用剪刀剪去長毛后，20%硫化鈉脫毛。脫毛24 h后稱重，腹腔注射10%水合氯醛，待其充分麻醉后，使用臺式超級控溫燙傷儀對大鼠進行燙傷，設置溫度為120℃，探頭實際溫度為90℃，燙傷時間為18 s。燙傷后用紗布覆蓋或升高室內溫度以保持大鼠體溫恒定，防止大鼠麻醉燙傷后體溫過低而死亡。燙傷3 d后，剪取正常組和造模組背部燒傷皮膚組織，放入4%多聚甲醛溶液固定，做HE染色，觀察模型是否成功，造模成功病理切片顯示炎性浸潤嚴重。如圖1所示。

2.4 給藥 用棉簽蘸取相應藥物對各組燒傷大鼠創面進行均勻涂抹(模型組除外，高、中、低劑量組每次均涂抹1 mL左右，其中陽性對照組為市面上銷售的燒燙傷膏)，每日1次，連續3周[7-9]。陽性對照組給藥劑量約為0.13 g·kg-1，高劑量用0.6 g·mL-1油桐花水提液，中劑量用0.3 g·mL-1油桐花水提液，低劑量用0.1 g·mL-1油桐花水提液。

2.5 標本采集處理 于用藥3周對各組大鼠背部進行圖片給采集。大鼠斷頭取血，收集血液，離心機3 000 rpm離心10 min，取血清，標記好-80℃保存。剪取各組大鼠背部燒傷皮膚組織，放入4%多聚甲醛溶液固定，備用。

2.6 Elisa試劑盒檢測 取出板條，室溫均衡20 min。標準品孔與樣本孔加樣。加入辣根過氧化物酶100 μL。封閉反應孔，37℃水浴鍋60 min。棄液體，濾紙拍干。洗滌液洗滌5次。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min。加終止液50 μL，450 nm波長測定各孔吸光度值。計算樣品實際濃度。

2.7 HE染色和免疫組化 4%多聚甲醛固定24 h后按常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，然后使用自動包埋機把組織包埋成蠟塊。切片后常規二甲苯脫蠟，經各級濃度乙醇脫水，然后進行蘇木素-伊紅HE染色或者用檸檬酸鹽緩沖液加入微波爐進行抗原修復，PBS洗3次，每次2 min。滴加封閉液，37℃恒溫箱30 min。棄多余液體，不洗。滴加適當稀釋的兔1 gG(一抗)4℃過夜。PBS洗3次，每次2 min。滴加二抗，37℃恒溫箱30 min。PBS洗3次，每次2 min。DAB顯色，鏡下觀察，適時終止。自來水充分沖洗返藍5 min。蘇木素輕度復染，室溫30 s。自來水沖洗2 min，80%，95%，100% ，100% Ⅱ的乙醇脫水各1 min；二甲苯 Ⅰ 2 min，二甲苯 Ⅱ 2 min透明。中性樹脂封片，檢視。

3 結果

3.1 大鼠燒燙傷創面恢復結果 不同劑量組油桐花水提物對大鼠燒傷創面恢復有明顯效果，與模型組比較傷口直徑明顯減小。如圖2所示。

3.2 Elisa檢測 燒傷大鼠血清中Bcl-2、Bax表達情況見表1，與正常組比較，模型組血清中Bcl-2表達顯著降低(P<0.01)，中劑量組、低劑量組血清中Bcl-2表達顯著升高(P<0.01)，高劑量組與陽性對照組血清中Bcl-2表達無差異。與模型組比較，不同油桐花水提物劑量組及陽性對照組大鼠血清中Bcl-2表達水平顯著上調(P<0.01)。

組別N劑量/g·kg-1Bcl-2/pg·mL-1正常組10-83.3±6.27*模型組10-64.9±9.10#陽性對照組100.1377.1±1.26*高劑量組102.0085.3±5.00*中劑量組101.00 162±23.0*#低劑量組100.33 118±8.77*#

注：與模型組比較，*P<0.01；與正常組比較，#P<0.01。

3.3 HE染色 模型組與正常組比較有大量纖維組織增生及炎性細胞浸潤，皮下組織變性、壞死，模型制備成功。中劑量組和低劑量組基本無炎性細胞浸潤，高劑量組和陽性對照組細胞輕度浸潤。如圖3所示。

3.4 免疫組化 與正常組比較，模型組促凋亡因子Bax表達水平顯著升高。與模型組比較，油桐花水提物高、中、低劑量組促凋亡因子Bax表達水平下調。與模型組比較，油桐花水提物高、中、低劑量組抑凋亡因子Bcl-2表達水平上調。如圖4、5所示。

4 討論

燒傷是日常較為常見的意外傷害，一般因火焰燒傷、熱接觸傷、熱液燙傷、電燒傷等造成嚴重炎癥反應和疼痛，給人們的日常生活帶來嚴重危害。中醫藥在治療燒燙傷方面具有歷史悠久、經驗豐富的優勢[10-11]。Bcl-2家族是細胞凋亡研究的一大熱點，在細胞凋亡調控中發揮了重要作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促進凋亡蛋白[12]。Bcl-2/Bax比率是啟動細胞凋亡的“分子開關”，細胞凋亡程度常用Bcl-2/Bax比率表示[13]。當Bax形成同源二聚體時誘導細胞凋亡；Bax與Bcl-2形成同源二聚體時抑制細胞凋亡[14-15]。試驗及臨床中常通過調節這兩種蛋白表達來達到治療的目的。油桐花為油桐(Vernicia fordii)所結的花，油桐又名桐子，為大戟科油桐屬落葉小喬木，主要分布于四川、貴州、云南等省區[2,16]。油桐性味澀、微寒、有毒，歸肺、心經，具有清熱解毒，生肌的功效，油桐全株皆可入藥，在民間有將其用于促進傷口愈合、消腫、鎮痛、止血、消毒、麻醉等作用，油桐全身都是寶[4,16]，其開發利用價值，還需人們不斷研究。

造模3天HE染色結果證明顯示燒燙傷炎性浸潤嚴重，造模成功。用藥干預后HE染色結果證明，模型組大鼠皮膚組織內有大量炎性細胞浸潤，燒傷大鼠模型制備成功，且油桐花水提物高、中、低劑量組皮膚組織內炎性細胞浸潤有不程度的緩解，對燒傷有一定療效。免疫組化檢測結果表明，燒傷大鼠模型組皮膚組織中Bax表達較高、Bcl-2表達較低，而油桐花干預組大鼠皮膚組織中Bax表達較低、Bcl-2表達較高。由此可推測出，油桐花水提物可通過上調燒傷皮膚組織抑凋亡因子Bcl-2表達及下調燒傷皮膚組織促凋亡因子Bax表達，從而抑制細胞凋亡發生，促進燒傷創面愈合。Elisa檢測結果說明，與正常組比較，模型組血清中Bcl-2表達顯著降低。與模型組比較，不同油桐花水提物劑量組及陽性對照組均能顯著上調大鼠血清中Bcl-2表達水平，增強皮膚組織抑制細胞凋亡作用。同時，在Elisa檢測過程中，中劑量組和低劑量組Bax表達不穩定，不做統計；但其余4組表達是穩定可用的，正常組為(5.18±0.20)pg·mL-1、模型組為(3.75±0.09)pg·mL-1、陽性對照組為(6.03±0.57)pg·mL-1、高劑量組為(4.67±0.41)pg·mL-1，與模型組比較，正常組、高劑量組、陽性對照組血清中Bax表達有差異。油桐花水提物可以抑制燒傷大鼠血清中細胞凋亡，從而調節外周血中細胞凋亡，從而緩解大鼠燒燙傷。說明Bax、Bcl-2對燒燙傷形成與發展具有重要作用，油桐花水提物可通過上調燒燙傷大鼠中抑凋亡蛋白Bcl-2，從而調節Bcl-2/Bax比率，平衡Bax、Bcl-2含量，緩解燒燙傷病情。同時為后續進一步研究油桐花不同溶劑提取物，如醇提，乙酸乙酯提取、氯仿提取等，篩選出最佳干預燒燙傷溶劑提取物奠定一定實驗基礎。

綜上，油桐花水提物可抑制燒傷大鼠細胞凋亡，恢復創面燒燙傷，與陽性藥物燒燙傷膏作用相似，大鼠皮膚燒燙傷會導致皮膚組織中細胞凋亡升高。油桐花水提物可以通過抑制細胞凋亡，從而促進創面愈合，緩解燒燙傷病情。