HPLC法測定克班寧脂質(zhì)體中克班寧的含量

云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500

克班寧(Crebanine，Cre)是由防己科千金藤屬植物“山烏龜”中提取得到的異喹啉類阿樸菲型生物堿。前期研究發(fā)現(xiàn)[1-2]其具有較強的心血管藥理活性，對多種實驗性心律失常具有較強的對抗作用，且起效迅速，維持時間較短，是值得深入研究開發(fā)的生物活性物質(zhì)。由于前期研究[3-5]已發(fā)現(xiàn)克班寧具顯著活性的同時也有較明顯的毒性，故研究將克班寧制成脂質(zhì)體，使其毒性降低，安全有效地發(fā)揮其抗心律失常作用。本實驗采用HPLC方法測定脂質(zhì)體中克班寧的含量，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為克班寧脂質(zhì)體的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1 100高效液相色譜儀(自動進(jìn)樣器、二級管陣列檢測器、恒溫柱溫箱)， C18色譜柱(Diamonsil C18, 4.6 mm×250 mm，5 μm)； 電子天平(Sartorius BT 25 s)，SK 250 HP 超聲清洗儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 克班寧對照品(自制[6])；大豆磷脂(批號：20140202，上海太偉藥業(yè)有限公司)；膽固醇(批號：20110708，中國新興化工試劑研究所)；克班寧脂質(zhì)體屬于自制；甲醇、三乙胺等流動相所用試劑均為色譜純，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 克班寧脂質(zhì)體的制備 采用逆向蒸發(fā)法制備空白脂質(zhì)體，處方按照大豆卵磷脂、膽固醇質(zhì)量比5∶1，并用適量氯仿溶解，加入量取一定量的pH為3的檸檬酸水溶液，超聲混勻成W/O型乳劑，置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上30℃恒溫水浴減壓蒸發(fā)除去氯仿，得空白脂質(zhì)體混懸液。以藥值比1∶4取適量鹽酸克班寧與空白脂質(zhì)體混合均勻并用Na2HPO4調(diào)pH至5.8，50℃恒溫水浴20 min，即得克班寧脂質(zhì)體。

2.2 樣品溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取克班寧(含量94.1%)0.3 g置100 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取“2.1”項下克班寧脂質(zhì)體1 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，作為供試品。

2.2.3 陰性對照品溶液 精密稱取卵磷脂3.3 mg,膽固醇0.67 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即為陰性對照品。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Diamonsil C18( 4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.008%三乙胺水(75∶25)；流速為1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：280 nm。

在上述色譜條件下，取克班寧標(biāo)準(zhǔn)品，克班寧脂質(zhì)體供試品及陰性對照品，分別取10 μL注入液相色譜儀進(jìn)行測定。系統(tǒng)適應(yīng)性測定結(jié)果(見表1)。克班寧的分離度大于9.10，理論塔板數(shù)按克班寧計算不少于5 000，克班寧的拖尾因子為1.08。結(jié)果表明：樣品中克班寧的色譜峰分離度、拖尾因子均能滿足《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥD高效液相色譜法項下規(guī)定，理論板數(shù)按克班寧計算均大于5 000，因此該色譜條件適合于克班寧脂質(zhì)體的分析，色譜圖如圖1所示。

2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下克班寧對照品，依次精密吸取0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、3 mL的上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于5 mL的容量瓶中加甲醇定容，即得濃度為0.06、0.12、0.24、0.30、0.60、1.20、1.80 mg/mL的克班寧系列標(biāo)準(zhǔn)品。分別精密吸取克班寧系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL注入液相色譜儀，照上述色譜條件測定峰面積，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。結(jié)果克班寧的回歸方程為A= 1839.6C-604.65 (r=0.999)，線性范圍為0.06～1.8 mg；表明克班寧在線性范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量有良好的線性關(guān)系。

表1 系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果

2.5 精密度試驗 分別精密吸取“2.2”項下供試品溶液各10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，結(jié)果峰面積的RSD為0.007924%，小于3%，結(jié)果表明精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.2”項下供試品溶液，在0、2、4、6、8 h分別進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，結(jié)果RSD值是0.024333%，小于3%，所以標(biāo)準(zhǔn)品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批次供試品6份，按照“2.2”項下方法，分別精密量取1 mL，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，分別經(jīng)微孔濾膜(0.45 μm)，過濾后再分別進(jìn)樣10 μL，結(jié)果6份樣品的平均RSD是0.303%小于5%，表明本法具有較好的重現(xiàn)性。

2.8 加樣回收率試驗 取“2.2”項下的標(biāo)準(zhǔn)品精取3 mL分別用甲醇定容于10 mL、50 mL、100 mL的容量瓶中，配得高(881.1 μg/mL)，中(440.55 μg/mL),低(88.11 μg/mL)克班寧對照溶液，分別取克班寧對照低、中濃度和高濃度各2 mL置于10 mL容量瓶中，再分別加入克班寧脂質(zhì)體樣品(2.81 mg/mL)3 mL于容量瓶，用甲醇定容，搖勻，經(jīng)微孔濾膜(0.4 μm)過濾后再分別取10 μL注入液相色譜儀，照該品含量測定方法，測定含量，計算平均回收率為101.56%，RSD值為6.77%。表明本實驗回收良好。見表2。

2.9 樣品測定 取克班寧脂質(zhì)體4批，依上述HPLC法測定克班寧脂質(zhì)體中克班寧含量，每份樣品測定兩次，結(jié)果4批樣品平均含量的53.95%，為后期研究工作提供研究方法。

表2 克班寧脂質(zhì)體溶液加樣回收率試驗結(jié)果

3 討論

脂質(zhì)體作為新型藥物輸送系統(tǒng)，具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，能使藥物延長藥效、改變被包封藥物的體內(nèi)分布，提高藥物的治療指數(shù)，減少藥物的治療劑量和降低毒性。而克班寧毒性大、在動物體內(nèi)為超速處置類(t1/2<1 h)藥物，利用脂質(zhì)體作為輸送介質(zhì)，達(dá)到延長藥效和降低毒性的目的。為后期克班寧在抗心律失常的應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。采用HPLC對克班寧脂質(zhì)體進(jìn)行含量測定，操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于克班寧納米脂質(zhì)體的質(zhì)量控制。在實驗中，參照文獻(xiàn)[7]流動相比例進(jìn)行含量測定，而因脂質(zhì)體膜材料即卵磷脂和膽固醇的影響，最終以甲醇-0.008%三乙胺水比例是75∶25能得到理想的分離效果。為克班寧脂質(zhì)體的后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。