RP-HPLC法測定消癥散中芍藥苷的含量

云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000

乳腺包塊的形成，主要與肝氣郁結、痰凝血瘀、沖任失調等諸多原因有關。消癥散是曲靖市中醫(yī)醫(yī)院研制的制劑，主要含有柴胡、當歸、赤芍、昆布、浙貝母、茯苓、白術等藥物，具有調沖疏肝、清熱活血、軟堅散結的功效，用于治療內分泌失調引起的乳腺小葉增生及各種原因引起的乳房包塊。方中柴胡、茯苓、白術等可調理沖任，疏肝理氣，昆布能軟堅散結，赤芍、當歸活血化瘀。諸藥協(xié)同作用，可使體內分泌機能得于調整，激素水平達到新的平衡狀態(tài)，從而起到良好的治療效果。消癥散現(xiàn)行質量標準以薄層色譜鑒別芍藥苷來控制處方中的赤芍[1-2]，未建立制劑中赤芍的含量測定方法。本研究參照文獻[3-8]，以芍藥苷為定量控制指標，采用反向高效液相色譜法對芍藥苷進行含量測定，為有效控制“消癥散”質量提供了準確可靠且簡便易行的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 AgiLent 1200型高效液相色譜儀(包括G1311A系列四元泵，G1315D DAD檢測器，G1316A 柱溫箱，G1329A自動進樣器)；KQ-300UDB型雙頻數控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；METTLE MS205DU電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；一體式超純水儀(PURELAB FLex 3，英國ELGA公司)。

1.2 試劑 芍藥苷(批號:110736-201640，中國食品藥品檢定研究院)，乙醇為分析純，磷酸為分析純，水為純化水。消癥散(批號：160905、161114、170202，曲靖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 ODS HYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸溶液(12∶88)為流動相；流速為1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：230 nm；進樣量10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取本品內容物，混勻，取約 2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(頻率：45 KHz，功率300 W)30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品儲備液的制備 精密稱取芍藥苷對照品20.25 mg，置50 mL量瓶中，加70%的乙醇適量，振搖溶解后，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻。即得芍藥苷質量濃度為385.56 μg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按消癥散處方要求，分別稱取除赤芍以外的其他藥材，按照消癥散制備工藝，制備不含赤芍的陰性樣品，并按“2.2.1”項下制備陰性樣品溶液。

2.3 線性關系的考察 分別精密吸取“2.2.2”項下芍藥苷對照品儲備液適量，加70%乙醇稀釋制成含芍藥苷分別為(單位：μg/mL)：192.78、96.39、48.20、24.10、12.05的系列對照品溶液。在“2.1”項下色譜條件進樣分析，以對照品濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，計算線性回歸方程，得芍藥苷的回歸方程Y= 15.8948X+23.6027(r= 0.9997)。結果表明：芍藥苷濃度在12.05～192.78 μg/mL 范圍內具有良好線性關系。

2.4 精密度試驗 精密吸取同一芍藥苷對照品溶液(含芍藥苷96.39 μg/mL)照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，測定峰面積值。結果表明精密度良好，其峰面積值的RSD為0.6%。

2.5 重復性試驗 取同一批次消癥散(批號160905)6份，按“2.2.1”項下的方法處理，考察方法的重復性。記錄相應的峰面積，計算結果。結果表明供試品中芍藥苷含量測定重復性良好，RSD為0.4%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液(批號160905)，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件進行分析。結果表明供試品溶液在室溫下放置24 h質量基本穩(wěn)定，芍藥苷含量的RSD為0.9%。

2.7 回收率試驗 分別取已知含量的同一批消癥散(批號160905)約 1 g，精密稱定，共6份，分別精密加入對照品儲備液(濃度為385.56 μg/mL)5 mL,按“2.2.1”項下的方法處理，制備供試品溶液，分別測定，計算回收率。平均回收率為 98.95 % ，RSD為1.3%。見表1。

表1 回收率測定結果 (n=6)

2.8 專屬性試驗 將陰性樣品溶液按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，見圖1。結果色譜圖中在芍藥苷相應出峰位置未出現(xiàn)干擾峰。

2.9 樣品含量測定 取不同批號的供試品3批按“2.2.1”項下的方法處理，制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，按上述色譜條件測定峰面積積分值，以外標法計算芍藥苷的含量。見表2。

表2 樣品含量測定結果 (n=3)

3 討論

3.1 流動相的選擇 實驗先后試用了乙腈-0.1%磷酸，甲醇-2%醋酸溶液，乙腈-2%醋酸溶液，甲醇-0.5%醋酸溶液多個組合為流動相測定樣品和對照品中芍藥苷的含量，含有醋酸的流動相基線不平穩(wěn)，噪聲太大。乙腈-0.1%磷酸為流動相時基線較平穩(wěn)，噪聲小，主成分峰形較好，并且樣品中的芍藥苷與其他成分能很好的分離。所以本實驗最后采用了乙腈-0.1%磷酸(12∶88)為流動相。

3.2 提取方法的選擇

3.2.1 提取方法的確定 實驗參考了《中華人民共和國藥典》(一部)[2]白芍中芍藥苷的提取方法，結果顯示超聲提取效果良好，且提取方法簡單方便，加標回收率高，故選用超聲提取。

3.2.2 超聲時間的確定 精密稱取樣品(批號160905)5份，每份約2 g，置100 mL量瓶中，加入70%乙醇適量,分別超聲(頻率：45 kHz，功率：300 W)處理10、20、30、40、50 min后測定芍藥苷含量,結果超聲30 min后，芍藥苷含量基本不再改變，證明樣品超聲處理30 min后，能將樣品中的芍藥苷提取完全，所以超聲(頻率：45 kHz，功率：300 W)時間確定為30 min。

本實驗方法準確、快速、簡便可靠，結果穩(wěn)定，可用于消癥散中芍藥苷的含量測定。