HPLC-DAD法測定西藏產(chǎn)區(qū)金銀花花蕾及葉中化學成分含量

劉倩，張敏敏，李圣波，梁琰,3，劉偉，程素盼,4，王曉，耿巖玲，趙恒強*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)，山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014；2.青海亞特生物科技有限公司，青海 西寧 810000；3.山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 27101834.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東 濟南 250355)

金銀花為忍冬科(Caprifoliaceae)植物忍冬(LonicrajaponicaThunb.)的干燥花蕾或帶初開的花，為藥食兼用型植物。其性寒味甘，歸肺、心、胃經(jīng)，屬清熱解毒、疏散風熱之要藥[1-3]。作為常用中藥，金銀花在我國流通及使用的品種復雜多樣。“亞特一號”良種金銀花，為山東亞特生態(tài)技術有限公司以我國立本大葉金銀花中產(chǎn)生的自然優(yōu)良系株為基本，與美國優(yōu)良品系金銀花進行雜交，再經(jīng)無性繁殖等方法；栽種、培育而成的系列新品種。該品種具有抗逆性強、耐旱、耐澇、耐寒熱、耐土壤瘠薄，抗病性強，易繁殖，根系發(fā)達等優(yōu)勢，有非常高的藥用及經(jīng)濟價值[4-7]。本實驗研究對象即為在西藏產(chǎn)區(qū)種植的“亞特一號”良種金銀花。現(xiàn)代藥理學研究表明，金銀花中含有有機酸、黃酮、環(huán)烯醚萜苷等復雜的化學成分，具有抗菌、抗病毒、增強免疫力、利尿和降低膽固醇等作用[8-12]。2015版《中國藥典》[13]中僅以綠原酸和木犀草苷兩個指標對金銀花進行質量控制，具有較大的局限性。高效液相色譜技術結合標準品指認方法，能夠對中藥中復雜的化學成分進行初步分析、鑒定[14-17]。因此，本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器技術(HPLC-DAD)對西藏產(chǎn)區(qū)的8批“亞特一號”良種金銀花花蕾和葉中的8種主要成分綠原酸、木犀草苷、隱綠原酸、異綠原酸、馬錢酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷、蘆丁進行分析和含量測定，并與道地產(chǎn)區(qū)——山東產(chǎn)金銀花進行對比。該研究為快速了解西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的化學成分含量和其后續(xù)臨床應用提供了方法指導和數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

ACCHROM 6000高效液相色譜儀(北京華譜科儀科技有限公司)；BSA萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)；SB-5200D型高功率數(shù)控超聲波儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 實驗材料

實驗所需樣品均為西藏產(chǎn)區(qū)拉薩市采摘的“亞特一號”良種金銀花，其中包含8批金銀花花蕾和8批葉樣品，經(jīng)山東省分析測試中心王曉研究員鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的花和葉。對照品綠原酸(批號：Y24J7K16726)、異綠原酸C(批號：MUST-14111414)、隱綠原酸(批號：MUST-15011413)、木犀草苷(批號：MUST-15012204)、蘆丁(批號：Y22S6S3719)、馬錢酸(批號：MUST-15012207)、馬錢苷(批號：R23D7F27552)、斷氧化馬錢苷(批號：Y21D7B30456)均購于上海源葉生物科技有限公司(純度均大于98%)。乙腈、乙酸為色譜純(美國Tedia公司)，實驗用水為Milli-Q 超純水(18 MΩ)，其他試劑為分析純。

2 實驗方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

將金銀花藥材粉碎，過4號篩。精密稱取金銀花藥材粉末0.2 g，甲醇溶液10 mL，40 ℃水浴加熱提取10 min，后加入純水5 mL，超聲(功率250 W，頻率20 kHz)30 min復提，用70%甲醇水溶液補足減失的質量，提取液過0.22 μm有機濾膜，即得供試品溶液。

2.2 標準品溶液的制備

精密稱取馬錢酸(1)、綠原酸(2)、隱綠原酸(3)、馬錢苷(4)、斷氧化馬錢苷(5)、蘆丁(6)、木犀草苷(7)、異綠原酸C(8)對照品適量，加甲醇配制成濃度分別為1.0 mg/mL的對照品溶液，其中木犀草苷(70%甲醇)配制為0.5 mg/mL 的對照品溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 色譜條件

ACCHROM 6000高效液相色譜儀(北京華譜科儀科技有限公司)，Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱。流動相A為乙腈，流動相B為水(0.2%甲酸)，梯度洗脫：0～10 min，8%～10% A；10%～20 min，10～15% A；20～30 min，15%～15% A；30～40 min，15%～25% A；40～50 min，25%～30% A，50～51 min，30%～100% A；51～60 min，100%～100% A；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：254 nm。

2.4 HPLC方法學考察

2.4.1 線性關系考察

將木犀草苷、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸、馬錢酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷、蘆丁8種對照品溶液分別稀釋，得到不同濃度的對照品混合溶液，按照2.3項下色譜條件進樣分析，得到8種對照品的液相色譜圖，見圖1。以峰面積積分值(y)對質量濃度(x)進行回歸計算，各化合物的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢測限、定量限見表1。

表1 樣品回歸方程、檢出限和定量限Table1 Regression equations、detection limit and quantitative limit of samples

圖1 “亞特一號”金銀花蕾、葉提取物及8種對照品的HPLC色譜圖(254 nm)Fig.1 HPLC chromatograms of extracts of flower buds and leaves of Lonicera japonica “AT1” and 8 kinds of control products(254 nm)

2.4.2 精密度實驗

取供試品溶液(批號為金銀花蕾1)連續(xù)重復進樣6次，測得其中8個特征峰的峰面積和保留時間，分別計算其相對標準偏差(RSD)，其特征峰保留時間RSD依次為0.9%、0.9%、0.9%、0.7%、0.6%、0.9%、0.4%、0.2%，均小于1.0%，峰面積RSD依次為3.1%、0.6%、3.7%、3.6%、0.8%、2.7%、0.8%、2.0%，均小于5.0%，結果符合實驗技術要求，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實驗

取供試品溶液(批號為金銀花蕾1)，按照2.3項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣分析，記錄色譜圖。結果表明，8個特征峰保留時間RSD依次為1.1%、0.9%、0.9%、0.8%、0.6%、1.0%、1.5%、1.2%，峰面積RSD依次為4.8%、0.5%、4.8%、3.3%、0.8%、2.9%、1.8%、1.9%，均小于5%，表明樣品溶液在室溫條件下24 h內化學穩(wěn)定性良好，符合實驗技術要求。

2.4.4 重復性實驗

取供試品(批號為金銀花蕾1)6份，按2.1項下處理方法制成供試品溶液，按照2.3項下色譜條件進樣測定，測得8個特征峰的峰面積和保留時間，并計算其RSD。結果表明，8個特征峰保留時間RSD分別為1.0%、1.0%、1.0%、0.7%、0.6%、1.0%、0.5%、0.2%，峰面積RSD分別為4.7%、0.9%、4.1%、3.4%、0.8%、2.9%、0.7%、2.4%，均小于5.0%，結果表明方法重復性良好，符合實驗技術要求。

2.4.5 加標回收率

精密稱取取供試品溶液(批號為金銀花蕾1)樣品6份，每份0.2 g，分別按照樣品中8種指標成分含量80%、100%、120%共3個水平，加入對照品溶液，按2.1項下處理方法制成供試品溶液，按照2.3項下色譜條件進樣測定。馬錢酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、斷氧化馬錢苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸C的平均回收率分別為93.32%、94.15%、91.52%、91.01%、92.17%、104.33%、92.52%、95.67%；RSD分別為2.35%、3.20%、4.17%、3.02%、3.09%、3.98%、3.47%、2.36%。

2.4.6 含量測定

分別取8批亞特一號金銀花蕾和葉，采用2.1供試品溶液制備方法制備樣品溶液，采用2.3色譜條件分別進樣分析，得出上述8種化合物的相應峰面積，根據(jù)2.4.1方法中回歸方程算出各化合物的含量，平行3次取平均值，結果見表2。

表2 8批金銀花蕾和葉的含量測定結果(n=3)Table 2 Content determination results of 8 batches of flower buds and leaves of Lonicera japonica μg·g-1

續(xù)表2

馬錢酸綠原酸隱綠原酸馬錢苷斷氧化馬錢苷蘆丁木犀草苷異綠原酸C金銀花葉74 581.241 793.51 068.6719.22 750.82 164.99 106.3488.7金銀花葉83 599.432 182.3736.5605.22 130.51 887.76 913.7402.7金銀花葉平均值3 952.435 844.7833.4686.72 412.51 793.87 901.9456.7

3 討論

3.1 提取條件優(yōu)化

超聲提取法具有快速、簡便等優(yōu)點，而水浴加熱提取法具有耗時短、提取率高等特點，本研究采用水浴加熱提取法結合超聲提取法來用于金銀花和金銀花葉中成分的提取，同時考察了提取溶劑、提取時間等因素對提取效率的影響。

考慮到金銀花中含有的化合物種類繁多，極性差別較大，故選擇先采用純甲醇作為提取溶劑水浴加熱，提取其中含有的極性較低的化合物；再加入純水，超聲提取其中高極性的化合物。綜合比較分析，通過增加水在提取溶劑中的比例，可以得到較多的色譜峰，故本實驗選擇先采用10 mL純甲醇水浴加熱，再加入5 mL純水超聲提取。水浴提取時，采用10 min和20 min提取無明顯差別，故選擇水浴加熱10 min作為第一次提取時間；加入5 mL純水，分別超聲提取15 min、30 min和45 min，結果顯示30 min和45 min提取效率高于15 min，但采用30 min和45 min提取無明顯差別，故選擇時間較短的30 min作為第二次提取時間。

3.2 HPLC條件優(yōu)化

金銀花提取物中化學成分復雜多樣，化合物極性差別較大，故采用洗脫范圍較廣的乙腈-水作為流動相對金銀花提取物進行洗脫。另外，本實驗考察比較了Agilent SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱，Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱以及SymmetryC18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱共3個不同類型C18柱對金銀花提取物的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)，采用Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱時分離度較好、色譜峰較多。因此，選用該柱對提取物進行色譜分離分析。由于金銀花中有機酸類含量較高，色譜峰容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，故考慮通過在流動相中加入少量的酸來改善分離度及峰型。考察了在水相中分別加入0.1%、0.2%、0.4%甲酸、0.2%和0.4%乙酸，對金銀花提取物色譜分離的影響，結果發(fā)現(xiàn)在水相中加入0.2%甲酸時色譜峰對稱性較好、峰型較好，因此，選擇乙腈-0.2%甲酸作為流動相。在波長選擇上，經(jīng)二極管陣列檢測器考察金銀花提取物中各類成分在190～400 nm波長下的紫外吸收效果，結果發(fā)現(xiàn)在254 nm下金銀花中各成分均有吸收且有較好的分離度，因此，選擇254 nm作為金銀花提取物的檢測波長。同時考察得出柱溫25 ℃時，色譜峰分離度和峰型較好，因此選擇在此柱溫下進行分析。

3.3 金銀花中活性成分含量的對比

從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，西藏產(chǎn)區(qū)金銀花花蕾中綠原酸的含量最高，平均含量為3.85%，斷氧化馬錢苷的含量最低；在金銀花葉中，綠原酸含量最高，平均含量為3.58%，異綠原酸C的含量最低。綜合金銀花蕾和葉的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷和異綠原酸C的含量分布中，金銀花蕾高于金銀花葉；而馬錢酸、斷氧化馬錢苷、蘆丁和木犀草苷4種成分含量在金銀花葉中分布高于金銀花蕾。

與金銀花道地產(chǎn)區(qū)山東所產(chǎn)的10批金銀花樣品進行對比，結果發(fā)現(xiàn)西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的綠原酸平均含量(3.85%)遠高于山東產(chǎn)區(qū)(1.62%)，而木犀草苷、異綠原酸C和馬錢酸的平均含量均略高于山東產(chǎn)區(qū)，蘆丁的平均含量則低于山東產(chǎn)區(qū)[18]，見圖2；與不同產(chǎn)地來源、品種的金銀花相比較，發(fā)現(xiàn)包含道地產(chǎn)區(qū)山東在內的如河南、陜西、重慶、河北等13個金銀花樣品中綠原酸和木犀草苷的含量分別在2.23%～3.16%和0.085%～0.193%范圍內[19-21]，而本研究中西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的綠原酸含量為3.36%～4.45%，木犀草苷含量為0.12%～0.17%，結果表明西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花中的綠原酸含量明顯高于一般品種的金銀花，木犀草苷含量也略高于多數(shù)品種的金銀花。

圖2 西藏金銀花和山東金銀花的活成分含量對比Fig.2 Comparison of active ingredient contentbetween Lonicera japonica in Tibet and that in Shandong

4 結論

本研究采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器技術(HPLC-DAD)，對西藏產(chǎn)區(qū)的8批“亞特一號”良種金銀花花蕾和葉進行了分析，并采用多指標定量對其進行質量評價，得到的含量數(shù)據(jù)與其他產(chǎn)地、品種的金銀花進行了對比。研究結果為西藏產(chǎn)區(qū)“亞特一號”良種金銀花的進一步開發(fā)、利用提供方法和數(shù)據(jù)支持。