不同株系丹參有效成分比較研究

梁從蓮，張永清，李佳，劉謙，蒲高斌

(山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

丹參為唇形科植物丹參(salviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖，具有活血通絡、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩等功能，對心血管等疾病作用顯著[1-3]。近年來丹參臨床應用范圍不斷擴大，市場需求逐年增加。目前丹參在我國各省均有種植，但品質差異較大。長期以來，丹參優良品種選育的工作相對比較滯后，缺乏優良品種的推廣，從而限制了丹參產業的健康發展[4-6]。丹參有效成分按溶解性可分為脂溶性和水溶性化學成分。2015版中國藥典以丹參酮ⅡA作為其脂溶性代表成分，以丹酚酸B作為水溶性代表成分，進行含量控制[7]。本研究選取包括丹參酮ⅡA在內的4種脂溶性成分和包括丹酚酸B在內的3種水溶性成分進行含量測定，將有效成分的含量作為評價丹參種質優劣的標準之一，探討活性成分的含量變化規律，比較不同株系丹參之間的有效成分的差異，為進一步的丹參優良種質的篩選提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

1.1.1 實驗材料

本實驗所用原植物均來自于山東中醫藥大學藥用植物園，經山東中醫藥大學張永清教授鑒定，確認均為3年生唇形科丹參。根據株型、株高、花色、莖色、芽色、葉色和葉片大小等諸多方面的差異，確定為10個株系的丹參。

1.1.2 試劑

丹酚酸 B(PA048RA13)、迷迭香酸(20120809)、紫草酸(PF0225SA14)、丹參酮ⅡA(20130111)、二氫丹參酮Ⅰ(KN1113GH14)(上海源葉生物科技有限公司)；丹參酮Ⅰ(批號：110867-200406)、隱丹參酮(批號：110852-200806)(中國食品藥品研究院)；甲醇(AR)、乙腈(GR)(天津市富宇精細化工有限公司)；磷酸(GR)(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物學性狀測定

于2016年4月份開始對所研究丹參的外觀性狀，包括質量性狀(如芽色，花色，莖色，葉色等)和數量性狀(如株高，冠幅，葉，花，芽的大小等)進行觀察和測量。其中除芽的指標在4月份進行外，其他指標均在丹參盛花期7月中旬進行。取丹參芽，烘干殺青，研成粉末用色差儀測定其亮度、紅-綠值和黃-藍值。其他數量性狀借助卷尺、游標卡尺、棉線等工具，質量性狀主要通過肉眼觀察。每種株系測量10株，每株測量莖3枝，莖底部葉片3片,花序軸底部花3朵。每株系共獲得莖指標10項，葉指標30項，花指標30項。

1.2.2 取樣方法

2016年10月底采挖10種不同株系丹參的根部，除去泥沙。置烘箱中烘干至恒重，粉碎后用于含量測定。

1.2.3 對照品溶液制備

(1)水溶性成分：分別精密稱取干燥的水溶性對照品紫草酸0.72 mg、迷迭香酸0.30 mg、丹酚酸B 5.98 mg，置10 mL棕色量瓶中，75%甲醇溶解后定容，質量濃度分別為72、30、598 μg /mL。

(2)脂溶性成分：分別精密稱取干燥的脂溶性對照品丹參酮ⅡA 0.56 mg、丹參酮Ⅰ0.18 mg、隱丹參酮0.54 mg，二氫丹參酮0.14 mg置于10 mL棕色量瓶中，甲醇溶解后定容，質量濃度分別為56、18、54、14 μg/mL。用時稀釋成等梯度濃度。

1.2.4 供試品溶液制備

取丹參粉末約0.5 g(過40目篩)，精密稱定，置于洗凈烘干的磨口錐形瓶中，用移液管向其中加入甲醇50 mL，置于超聲清洗器中50 ℃超聲，40 min后取出放冷，搖勻，過濾，續濾液過0.45 mm濾膜，即得脂溶性成分樣品溶液。水溶性成分樣品溶液制備方法同脂溶性樣品，但是提取溶劑改為75%甲醇。

1.2.5 色譜條件

其中色譜柱采用Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相采用兩相流動相，分別為0.026%磷酸(A相)和乙腈(B相)。洗脫時采用梯度洗脫，但兩大類成分洗脫程序和檢測波長存在較大差異。水溶性成分的洗脫程序為：0～15 min，A相83%～77%，B相17%～23%；15～30 min，A相77%～75%，B相23%～25%；30～40 min，A相75%～10%，B相25%～90%；40～60 min，A相10%，B相90%。波長286 nm。脂溶性成分的洗脫程序為：0～20 min，A相80%～40%，B相20%～60%；20～60 min，A相40%～20%，B相60%～80%。波長270 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

1.2.6 方法學考察

(1)精密度試驗：取同1號樣品液連續進樣6次，計算色譜峰相對保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)，結果RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

(2)重復性試驗：取1號樣品5份，分別制得5個供試品溶液，進樣，計算色譜峰相對保留時間和峰面積的RSD，結果RSD均小于3%，說明儀器重復性良好。

(3)穩定性試驗：取1號樣品溶液，進樣后，再分別隔2、4、6 、12 h各進樣一次，計算色譜峰相對保留時間和峰面積的RSD，結果RSD均小于3%，表明7種成分穩定性良好。

(4)線性關系考察：分別吸取不同體積的二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 7種成分的標準品，分別以甲醇和75%甲醇溶解并稀釋制成10個不同質量濃度的系列溶液。按1.2.4所述色譜條件進行測定，以對照品的質量濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標，進行回歸處理，得到7個回歸方程，如表1 所示。

表1 丹參各活性成分對照品回歸方程Table 1 The regression equation of the active components of S.miltiorrhiza

1.2.7 數據分析

采用SPSS17.0對所得數據進行顯著性和相關性分析。

2 結果

2.1 生物學性狀

對10種株系的芽顏色進行測定，結合色差儀和肉眼觀察結果(表2)，按芽顏色區分10種株系可大體分為3類：淺紫(a<2,b>1.46)，深紫(a>3.5,b<0.5)和介于兩者之間的紫色。

表2 不同株系丹參芽顏色Table 2 The color of S.miltiorrhiza buds in different strains

注：L表示亮度，a表示紅-綠值，b表示黃-藍值。a值越大，表示顏色越偏于紅，越小則偏于綠；b值越大越偏于黃，越小越偏于藍。

表3 不同株系丹參數量性狀均值統計Table 3 Mean statistics of quantitative characters of S.miltiorrhiza in different strains

注：A表示所測每輪小花數的均值，B代表10 cm花序上的小花總數的均值。

圖1 不同株系丹參花的照片Fig.1 Photos of the S.miltiorrhiza flowers in different strains

表4 不同株系丹參整體性狀Table 4 The overall characters of different S.miltiorrhiza strains

結合表3，4及圖1以及原始數據分析，10種株系株高分布在35～85 cm之間，冠幅分布在1 017.876～13 171.32 cm2之間，平均分枝數3～23不等；莖長分布在30.5～79 cm之間，莖寬分布在4.03～7.32 mm之間；葉柄長分布在0.206～3.1 cm之間，葉長分布在2.7～12.7 cm之間，葉寬分布在1.7～3.9 cm之間，葉面積分布在5.59～34.73 cm2之間；花長分布在1.6～2.9 cm之間，花寬分布在0.8～2.2 mm之間，花輪間距分布在1～2.44 cm之間，每輪小花數3～9朵不等，柱頭長分布在1.9～4.4 cm之間。由此可知，10種丹參在植株形態上存在較大差異，可作為區分不同株系的性狀依據，在此基礎上,我們進行了后續的含量測定研究。

2.2 有效成分HPLC色譜峰

選取10種丹參株系的4種脂溶性成分二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和3種水溶性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B進行含量測定，標準品和樣品色譜圖見圖2和圖3。

1 迷迭香酸；2 紫草酸；3 丹酚酸B。圖2 水溶性成分HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of water-soluble components

1 二氫丹參酮Ⅰ；2 隱丹參酮；3 丹參酮Ⅰ；4 丹參酮ⅡA。圖3 脂溶性成分 HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of fat-soluble components

從圖2、3可以看出在本研究所用色譜條件下，4種脂溶性成分和3種水溶性成分與對照品保留時間一致，且各峰分離度較好。

表5 丹參活性成分含量(%，X±SD)Table 5 The content of active ingredients of different S.miltiorrhiza strains (%, X±SD)

注：相同字母代表兩組數據之間無顯著性差異，有顯著性差異的用不同字母表示。

由表5可知，二氫丹參酮Ⅰ的含量分布在0.023 3%～0.114 8%，隱丹參酮的含量分布在0.093 5%～0.397 4%，丹參酮Ⅰ的含量分布在0.037 2%～0.140 7%，丹參酮ⅡA的含量分布在0.066 2%～0.386 1%，迷迭香酸的含量分布在0.120 7%～0.287 5%，紫草酸的含量分布在0.194 5%～0.608 9%，丹酚酸B的含量分布在2.179 5%～5.215 1%。其中3、7號株系的丹參酮ⅡA含量最高，另三種脂溶性成分含量也較高，但其水溶性成分含量較低，且7號丹酚酸B的含量還不能達到藥典要求，鑒于此，可考慮將其作為脂溶性成分的提取原料用于工業提取。1、9、10號株系的丹酚酸B的含量較高，同理可考慮作為水溶性成分的提取原料用于工業提取。

差異性分析表明2、4、5、6、7、10號丹參的二氫丹參酮Ⅰ含量有顯著性差異，1、2、3、4、5、7、8、9號丹參的隱丹參酮和迷迭香酸含量有顯著性差異，1、3、4、5、6、8、9、10號丹參的丹參酮Ⅰ含量有顯著性差異，10種丹參的丹參酮ⅡA含量均有顯著性差異，1、3、4、5、6、7、9、10號丹參的紫草酸含量有顯著性差異，2、3、4、5、6、7、8、10號丹參的丹酚酸B含量有顯著性差異。

圖4 丹參脂溶性成分含量組成Fig.4 The composition of the fat-soluble components of different S.miltiorrhiza strains

圖5 丹參水溶性成分含量組成Fig.5 The composition of the water-soluble components of different S.miltiorrhiza strains

對所測定的4種丹參脂溶性和3種水溶性成分進行分析，發現丹參水溶性成分中丹酚酸B占三者之和的百分比為82.5% ～89.54%，從含量上可以體現藥典以丹酚酸B作為水溶性成分進行質控的合理性(圖4)；所測脂溶性成分中，丹參酮ⅡA占四者之和的百分比為27.68%～42.48%，隱丹參酮占四者之和的百分比為32.72%～44.96%(圖5)。可見在所測10種丹參株系，丹參酮ⅡA在含量上并無絕對優勢。王立萍等[8]對山東省內不同地區的丹參進行了脂溶性有效成分的含量測定，結果發現不同產地丹參隱參酮含量差異較大，其中濟南雞山產丹參隱丹參酮含量較高，本研究實驗材料均為濟南產丹參，故推測出現隱丹參酮含量和丹參酮ⅡA含量都占優勢的結果可能與產地有關。

2.4 相關性分析

研究表明，水溶性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B呈顯著正相關，脂溶性成分中除丹參酮ⅡA和二氫丹參酮Ⅰ之間相關性不明顯之外，其他脂溶性成分呈顯著正相關(表6)。水溶性和脂溶性成分之間并無顯著相關性，但通過數據可以看出，兩者多數為負相關，猜測兩大類成分在合成過程中用到的關鍵酶的合成以及酶催化等存在能量競爭，導致一大類成分偏高時另一類成分會相對偏低。

表6 丹參主要成分相關性分析Table 6 Correlation analysis of main components of different S.miltiorrhiza strains

注：**和*分別代表0.01和0.5水平的顯著相關。

3 討論

近年來，隨著丹參主要化學成分及藥理作用的研究逐步深入和心腦血管疾病患者的增多，丹參資源的開發和利用也隨之逐年加大,使得丹參市場需求量不斷擴大，加之以丹參為主的復方制劑及保健品的開發，使得丹參的市場需求每年可達上萬噸[9-12]。目前，栽培品為藥材丹參的主要來源。由于以農戶為單位的種植模式多分散，規模化程度較低，種植過程中只種不選，長期的無性繁殖導致種性退化，加之丹參本身異花授粉的特性，造成了栽培丹參品種混雜，藥材質量參差不齊，嚴重影響臨床用藥。優良品種的選育、推廣與生產可保證丹參藥材質量，提高產量、抗性等。本研究材料取自前期研究中發現的10種外觀性狀差異較大的丹參株系，在本文中對其外觀性狀進行了更為系統的統計分析，確定其在芽色，葉色，花色及植株大小等方面存在差異，以開展后續實驗，為良種選育提供材料。通過對10種株系丹參進行含量測定，發現研究材料在其主要脂溶性和水溶性成分上存在顯著差異。有些材料在脂溶性成分含量上占優勢，有些則在水溶性成分上占優勢，據此可考慮將其作為某一類活性成分的提取原料加以開發利用。在之后的選育過程中，可進一步跟進性狀和化學成分穩定性的測定，另據某些成分與產地相關性的推測，可開展驗證性的工作。